Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Ibrahim B. Durowoju; Kamaljit S. Bhandal; Jian Hu; Bruce Carpick; Marina Kirkitadze

doi:10.3791/55262

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioquímica

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

Published: March 04, 2017

doi:

10.3791/55262

Ibrahim B. Durowoju¹, Kamaljit S. Bhandal¹, Jian Hu¹, Bruce Carpick¹, Marina Kirkitadze¹

¹Analytical Research & Development,Sanofi Pasteur Limited

Summary

סריקת calorimetry דיפרנציאלי המודד את טמפרטורת מעבר התרמית (ים) ו אנרגית חום כוללת הנדרשת כדי לפגל חלבון. תוצאות שהתקבלו משמשות כדי להעריך את יציבות התרמית של אנטיגנים חלבון בניסוחי חיסון.

Abstract

סריקת calorimetry דיפרנציאלי (DSC) הוא שיטה אנליטית אשר מודדת את קיבולת חום הטוחנת של דגימות כפונקציה של טמפרטורה. במקרה של דגימות חלבון, פרופילי DSC לספק מידע על יציבות תרמית, ובמידה מסוימת הוא מעין "טביעת אצבע" מבנית שיכול לשמש כדי להעריך קונפורמציה מבני. הדבר מתבצע באמצעות קלורימטר סריקת הפרש המודד את טמפרטורת מעבר התרמית (נמסה בטמפרטורה; T _{מ ')} ואת האנרגיה הנדרשת כדי לשבש את יחסי הגומלין לייצוב המבנה השלישוני (אנתלפיה; ΔH) של חלבונים. נעשות השוואות בין הניסוחים כמו גם הרבה ייצור, והבדלי ערכים הנגזרים להצביע על הבדלים יציבים תרמית קונפורמציה מבני. נתונים הממחישים את שימוש DSC בסביבה תעשייתית עבור מחקרי יציבות, כמו גם ניטור צעדי ייצור עיקריים מופיעים הוכחה ליעילות של פרו זהtocol. לשם השוואה לשיטות אחרות להערכת יציבות התרמית של תצורות חלבון, DSC היא חסכונית, דורשת כמה צעדי הכנת מדגם, וגם מספקת פרופיל התרמודינמית מלא של תהליך התגלגלות החלבון.

Introduction

סריקה calorimetry דיפרנציאלי (DSC) היא שיטה ניסיונית אשר מודד את ההבדל ישירות ספיגת אנרגיית חום המתרחשים קרוב משפחה מדגם עזר במהלך שינוי הטמפרטורה מוסדר ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ^{^8,} ⁹ ^{^{^10,,}} ^{^11,} ^12. שבוצעה במשך קלורימטר סריקת הפרש, השיטה כרוכה החדרת אנרגית חום לתוך תא מדגם תא התייחסות בו זמנית תוך הגדלת הטמפרטורה זהה של התאים הם לאורך זמן ^{^2,} ^{^13,}14. בשל הבדל בהרכב המדגם ואת ההתייחסות, כמות האנרגיה שונה תידרש כדי להעלות את הטמפרטורה של התאים ^{^2,} ^{^12,} ^13. לפיכך, כמות העולה על האנרגיה הנדרשת כדי לפצות על הבדלי הטמפרטורה בין התאים נמדד בקורלציה ישירות תכונות תרמודינמיות ספציפיים של המדגם ^{^1,} ^3.

ב -1960, MJ אוניל וא ווטסון של פרקין אלמר פתחו את קלורימטר סריקת ההפרש הראשון למדוד את זרימת החום של חומרים מוצקים ^{^2,} ^{^3,} ^4. במקביל, PL Privalov ו- DR Monaseldze EL של המכון לפיזיקה, הרפובליקה של גאורגיה (ברית המועצות לשעבר) יצר קלורימטר adiabatic ההפרש ייחודי שיכול לשמש FOr ביוכימיים מחקר ^{^5,} ^6. בהמשך לכך, צוות של Andronikashvili במכון לפיסיקה, הרפובליקה של גאורגיה, דיווח קיבולת החום של ביומולקולות כגון חלבונים סיביים כדוריים, DNA, RNA באמצעות DSC ^{^7,} ^{^8,} ^9. מספר צוותים בראשות Sturtevant ^{^10,} ^{^11,} ^12, ברנדט ^13, ו Privalov ^{^14,} ^{^15,} ¹⁶ מתמקדת בפיתוח של תיאוריה ויישומים מעשיים של DSC לחקור את הפרטים התרמודינמית של התגלגלות חלבון. שווי DSC בלימוד מבנים מולקולריים גדולים כמו פאגים, הכלורופלסט, גבישים נוזליים פוספוליפידים, וחלבוני בשר גם דווח ¹⁷ </ ^sup>, ^{^18,} ^{^19,} ^20.

DSC הפכה כעת שבשגרה במחקר של תרופות ופיתוח עבור הערכת יציבות תרמית של ביומולקולות, במיוחד חלבונים ^{^1,} ^{^21,} ^22. זהו בעיקר בשל התקדמות מבחינת רגישות ואוטומציה של המכשור המשמש לביצוע הניסוי ^{^23,} ^24. כאן, התוצאה הסופית של הניסוי DSC, כלומר, קיבול חום טוחנת כפונקציה של הטמפרטורה, משמש כדי להעריך את הפרמטרים הבאים התרמודינמית (שינוי קיבול חום (ΔCp), אנתלפיה (ΔH), האנטרופיה (ΔS) אנרגיה חופשית, ו גיבס (ΔG)) באמצעות המשוואה הבאה:

eq1.jpg "/> (1)

(2)

(3)

(4)

(5)

איפה Cp נמדד קיבול חום; q הוא זרימת החום לתוך החומר למבחן; T ₀ ו- T הם הטמפרטורות התחלתי וסופי של המעבר בהתאמה ^{^22,} ^25. כמו כן ראוי לציין כי המשוואות לעיל חלות לחלבונים חד תחום שיכול לעבור מעבר של שתי מדינות והפיכות תרמית התגלגלות ^22. ניתוח של חלבונים מורכבים יותר (למשל, חלבונים שאינם שתי מדינות לשני עמים, ו oligomers) hותעיף דווח על ידי ואח 'פריירה. ^26; ג'ונסון et al. ^27; ו Kasimova et al. ^28.

על מנת לקבוע האם חלבון עובר המעבר של שתי מדינות או צורות ביניים במהלך denaturation תרמית, אנתלפיה נגזר באופן ניסיוני (ΔH; התייחס גם _קאל ΔH אנתלפיה קלוריות כמו) מושווה אנתלפיה נגזר באמצעות המשוואה van't הוף כדלקמן (גם המכונה אנתלפיה van't הוף; ΔH _VH):

(6)

איפה T _{מ 'היא} הטמפרטורה האמצע של המעבר, R הוא קבוע הגזים האידיאלי (1.987 cal mol ^-1 K ^-1) ו- Y הוא חלק קטן מהאוכלוסייה חלבון במדינת פרש ^{^16,} ^29. אםΔH _VH שווה ΔH _קאל; או ΔH _VH / ΔH _קאל שווה ל -1, אז החלבון עובר מעבר "הכל או לא כלום" (כלומר מעבר של שתי מדינות) ^{^16,} ^{^25,} ^29. עם זאת, אם ΔH _VH הוא פחות מ ΔH _קאל; או ΔH _VH / ΔH _קאל הוא פחות מ 1, החלבון עובר מעבר הלא שתי מדינות לשני עמים ^{^16,} ^{^25,} ^29. יחס ΔH _VH / ΔH _קאל גם תואם את חלקם של מבנה החלבון שנמס כיחידה שיתופית התרמודינמית או התחום ^26.

הפרמטרים התרמודינמית הנ"ל כגון ΔG ו ΔH לספק מידע שימושי על יציבות התרמית של חלבונים, כולל תרופות ביולוגיות ^30. עם זאת, הדגש יהיה מונח על T _מ 'ΔH בפרסום זה, כפי שהם על הערכים המדווחים עבור פרוטוקול זה. _מ T היא טמפרטורת נקודת האמצע של המעבר, שבו המקופל והמדינות הפרשיות של החלבון הן בשיווי המשקל (כלומר, ΔG = 0) ^{^25,} ^31. ככל T _{מ 'של} חלבון, גבוה יותר יציבות תרמית שלה ^31. ΔH תואמת את השטח מתחת לשיא (ים) של קיבול חום לעומת גרף טמפרטורה (הידוע גם בשם thermogram) שנוצר בסוף הניסוי DSC ^{^16,} ^25. זוהי האנרגיה הנדרשת כדי לפגל חלבונים והוא יכול לשמש כדי להעריך את החלק היחסי פעיל _(א F) בניסוח חלבון (כלומר, חלקם של חלבונים עם קונפורמציה פעיל מדגם) באמצעות המשוואה הבאה:

jove_content ">

(7)

איפה ΔH הוא אנתלפיה נגזר באופן ניסיוני של מדגם החלבון ו- Q הוא אנתלפיה שנקבע הפניה היטב מאופיינת או חלבון סטנדרטי ^22. האמידה _של F היא משמעותית לניטור היציבות בזמן האמת של מוצרים, כמו גם ביצוע מחקרי יציבות בתנאי קיצון כנדרשת בהנחיות ICH ^32. גם השוואה של ΔH מספק מידע על הקומפקטיות של קונפורמציה מבנה שלישוני של חלבון ^31.

פרוטוקול זה מפרט נוהל להערכת יציבות התרמית של חלבונים בסביבה תעשייתית כבר נעשה שימוש נרחב לגיבוש חיסונים. הוא פותח באמצעות קלורימטר סריקת הפרש אוטומטי שיוצר f תוצאות לשחזוראו ריכוזי חלבון נמוך כמו 300 מיקרוגרם / מ"ל.

Protocol

1. כלי Start-up הפעל את קלורימטר הסריקה דיפרנציאלי להגביר את הלחץ בתאים לדכא רתיחה של הדגימות וכן למנוע היווצרות בועות בטמפרטורות גבוהות. זו מושגת בדרך כלל על ידי אספקת חנקן לתוך המערכת. בהתאם החומר המהווים של התא (למשל, טנטלום, זהב, פלטינה, וכו '), לכוון את הלחץ של אספקת גז חנקן על פי הלחץ המומלץ על ידי היצרן כדי למנוע נזק לתא. לדוגמה, להגדיר את הלחץ של אספקת גז חנקן עד 45 psi עבור המכשיר בשימוש לפתח הליך זה, ואת הלחץ מעל 80 psi עלולה לגרום נזק לתא. ודא כי כל מאגרי חומר ניקוי מלאים עד הנפח הנדרש. חומרי ניקוי נדרשו לכלול חומרי ניקוי ומים לשטוף ולנקות את התא בהתאמה אחרי כל סיבוב מדגם. הגדר את הטמפרטורה של התא מחזיק מדגםלערך מתאים, רצוי 5 מעלות צלזיוס, כדי לשמור על שלמות המדגם לפני להתנסות. לדוגמא כנה 2. Dialyze מדגם נגד החיץ אשר ישמש כנקודת ההתייחסות לצורך הניסוי. לחלופין, חיץ elution שנאספו על השלב האחרון של טיהור חלבונים (elution טור כלומר) ניתן להשתמש. קבע את הריכוז של מדגם החלבון בשיטת קביעת ריכוז החלבון המתאימה ביותר כגון שיטת Kjedahl 33 או לורי שיטה 34. לשם השוואה אובייקטיבית של תוצאות, השתמש באותה השיטה בעקביות באותו המחקר. טווח הריכוז הנדרש עשוי להשתנות בהתאם לדגם של המכשיר. עבור המכשיר בשימוש בפרוטוקול זה, טווח עבודה עדיפה הוא 0.5 – 1 מ"ג / מ"ל. דגה למאגר מדגם ועיון בריק להיפטר microbubbles שיכולים לגרום נפח inaccurACY. שלב זה ניתן לדלג על מודלים קלורימטר חדשים. שימוש micropipette וטיפים סטרילי בתוך ארון biocontainment זרימה למינרית, טען את דגימות למאגר שלהם בזוגות לתוך 96 צלחות גם תואם עם המכשיר. מלא את שני הזוגות הראשונים של בארות עם חיץ ושני הזוגות האחרונים עם מים למאגר החיץ וסריקת המים בהתאמה. סריקות-חיץ חיץ לאמת את התאמתו של המכשיר לפני לדגום מדידה (הערכה כלומר טעות מכשור) וכן להקים בסיס; בעוד סריקות מים מנוהלות לנקות את התאים. מכסה את צלחת 96-היטב עם סרט אטים, ולהבטיח כי הבארות נסגרות כמו שצריך לפני שלקחת את הצלחת מתוך קבינט הבטיחות הביולוגי כדי למנוע זיהום מדגם. מניח את הצלחת בתא מחזיק המדגם בכיוון הנכון. 3. הגדרת פרמטר הניסיון הערה: בהתאם instrumentation, ניתן לטעון דגימות לתוך התא באופן ידני או באמצעות מזרק, או באופן אוטומטי באמצעות autosampler. במקרה זה (כלומר הגדרה תעשייתית), גידול autosampler משמש כדי לחסוך זמן. באמצעות תוכנת הרכישה, הזן את המידע המדגם לפי סדר הצלחת הועמסה כאמור בסעיף 2.4. זן ריכוזים אם זמין, אחרת, זן ערכי ריכוז לתוך תוכנת ניתוח לפני ניתוח נתונים (סעיף 4.2). בחר באפשרות המבטיח ניקוי של תאים עם חומר ניקוי לפני כל סריקה מדגם, אשר צריכה להיות מלווה בצעדים לשטוף במים מרובים כדי להבטיח שאין שאריות דטרגנט נותר בתאים. הגדר את הטמפרטורה ההתחלתית של הניסוי ל -20 מעלות צלזיוס, אבל זה יכול להשתנות בהתאם לידע הקודם של המדגם. עבור חלבונים ידועים, טמפרטורת התחלה שנקבעה מראש ניתן להשתמש, בעוד טמפרטורת התחלה נמוכה יכולה להיות מיושמת על דגימות ידועות. הגדר את הטמפרטורה הסופיתהניסוי, למשל 100 ° C. הטמפרטורה הסופית עשויה להשתנות בהתאם על ידע קודם של המדגם. הגדר את קצב הסריקה של הניסוי, למשל 60 ° C / שעה, המהווה את קצב הסריקה הטיפוסי. עם זאת, קצב סריקה עשוי להשתנות תלוי בידע מוקדם של המדגם, למשל 90 ° C / שעה, או 120 ° C / שעה. מומלץ לסרוק דגימות ידועות בשיעורי סריקה שונים כדי להעריך את קינטיקה של התגלגלות. דגימות סריקה חוזרות לחקור את ההפיכות של תרמית התגלגלות. השתלשלות חלבון נחשבת הפיכה אם אנתלפיה שהתקבל עבור הסריקה השנייה הוא לפחות 80% מהשווי האנתלפיה עבור הסריקה הראשונה. קבעו את טרמוסטט שלאחר הניסוי עד 10 מעלות צלזיוס כדי לשמור על שלמות התאים של קלורימטר. ודא כי פרמטרי הגדרת הניסוי נכונים לפני ביצוע הניסוי. אם הכל במקום, להתחיל בניסוי. 4. נתוניםalysis אחזור נתונים גולמיים מהניסוי ובחר מדגם אחד בכל פעם לניתוח. סריקת התייחסות לחסר, חיץ כלומר, מן הסריקה המדגמת. הערה: חיסור הפניה מתבצע באופן אוטומטי על ידי דגמים חדשים של מכשירי DSC. זן ערך ריכוז מדגם אם זה הושמט כאמור בסעיף 3.1. התאם ולחסר הבסיס מן thermogram רכשה לתת דין וחשבון על הבדלים ביכולות החום של מדינות שקופל ונפתח של חלבון אשר נגרמת על ידי חשיפה של קבוצות הידרופובי למים על התגלגלות. לינארי או הולם עקום מעוקב ניתן ליישם בהתאם לצורה של פרופיל DSC למדגם. לקבלת עקביות, אותו סוג של התאמה צריך לשמש במהלך מחקר, מחקר יציבות בזמן אמת למשל. צעד זה נדרש כדי לעבד את העקומה לשילוב השיא להשיג אנתלפיה של מעבר. בצע אינטגרציה שיא באמצעות שאינו ליניארי לפחות בכושר מרובע. בהתבסס על המוצריידע ליישם שתי מדינות לשני עמים או מודל הלא שתי מדינות לשני עמים. שתי מדינות לשני עמי מודל יכול לשמש עבור מעברים תרמיים שיתופיים אחת, ועבור חלבונים לא-מוכרים, להחיל מודל מדינה ללא ושתיים עד ידע מוצר נוסף זמין. במידת צורך, להתאים עקומה הולמת באמצעות הפונקציה ההולמת העקומה איטרטיבי של של התוכנה והציוד עד שיגיעו השווי צ'י המרובע נשאר קבוע. התוצאות שהתקבלו יציג את הערכים עבור נקודת האמצע של טמפרטורות המעבר (TM), אנתלפיה קלוריות (ΔH), ו אנתלפיה van't הוף (ΔH VH) של המדגם.

Representative Results

הנתונים הגולמיים מרוב ניסויי DSC מוצגים בתור שטף חום לעומת גרף טמפרטורה, כמו קלורימטר למעשה מודד את הפער בשיעור של זרימת חום לתוך התמיסה מדגם חיץ 35. לכן, אם שני התאים (כלומר תאי מדגם הפניה) מכילים פתרונות זהים במהלך ניסוי, את הנתונים הגולמיים מן הסריקה צריכים להיות קו ישר בלי שום שיאים נצפים. כל שיא נצפה ניתן לייחס טעות מדידה (פגום למשל או מזוהם תאים), וזאת הסיבה פועלת סריקות חיץ לפני לדגום ניתוח הוא מבחן התאמת מערכת נאות. איור 1 מדגים את התוצאה של סריקת חיץ אופיינית המציין כי קלורימטר היה במצב עבודה טוב לפני לדגום ניתוח. איור 2 מציג את הנתונים הגולמיים עבור ניסוי DSC שבוצעו על diffהמון erent של שתי דגימות חלבון. כפי שנרמז קודם לכן, הפסגות ציינו הם הבדלי שטף החום על מדגם המאגרים שלהם. הבדלים בריכוז מדגם יכולים לגרום וריאציות קיבול חום שרשם קלורימטר; עם זאת, הווריאציות הללו הן מנורמלות במהלך ניתוח מדגם כאמור בסעיף 4.2 של ההליך. ריכוזים גבוהים יותר גם יכולים לחשוף תחומי התרמודינמית נוספים לא תורם המעבר בריכוזים נמוכים. בנוסף, כל מעבר מייצג תחום התרמודינמית שעשויה לכלול תחומים מבניים אחד או יותר של החלבון 36. במקרה זה, החלבון 1 יש שלושה תחומים מבניים שנמסים בשיתוף פעולה. איור 3 מציג את התוצאות שנוצרו מהניתוח של הנתונים הגולמיים עבור חלבון 1 ו -2 מוצגים באיור 2, כלומר, לאחר חיסור בסיס וסיבי עקומת איטרטיביtting. Thermograms וכתוצאה מכך כבר מנורמל לסריקת שיעור (מתבצע באופן אוטומטי על ידי אלגוריתם שנקבע מראש בתוכנת הניתוח) וריכוז; ובכך, הצגת התוצאות של ניסוי קיבול חום השוואה מול גרפי טמפרטורה. תוכנת הניתוח משתמשת בנתוני קיבולת החום לעומת גרפי טמפרטורה, כגון T מ 'ΔCp, לגזור פרמטרים תרמודינמיים אחרים באמצעות וריאציות של המשוואות שניתנו לעיל תלוי cooperativity של חלבון התגלגלות. כאשר בודקים דגימות ידועות, הגדרת טווח הטמפרטורה המתאימה הוא חיוני. אחרת, thermograms שלם עלול לגרום, כפי שמודגם באיור 4. למרות T מטר מ- פרופילים כאלה ניתן לגזור, ΔH לא ניתן לקבוע במדויק. לכן, המדגם חייב להערכה מחדש עם טווח טמפרטורות גדול יותר כדי ללכוד את המעבר התרמי לחלוטין. כמה חלבונים גם מחדשטופס adily אגרגטים לאחר denaturation המלא, ותוצאה הוא קיבול חום שלאחר מעבר הגדלה: לעתים קרובות זה נראה כמו thermogram שלם כפי שמודגם באיור 2B. עם זאת, retesting עם טמפרטורה סופית גבוהה יכול לעזור לאשר אם יש התרחשות של מעבר קונפורמציה באותו האזור של thermogram או שזה רק האפקט קליט החום של אגרגטים חלבון. יציבות תרמית היא אחת התכונות הפיסיקליות המשמעותיות ביותר של חלבונים ומוצרים מבוססי חלבון בענף 37. בתחום התרופות, הוא משמש כדי לקבוע את היציבות של התרופות הביולוגיות בתנאים שונים, כולל כריות ניסוח וגורמים סביבתיים כגון לחות וטמפרטורה. כמו כן הוא משמש כדי לפקח צעד ייצור מפתח (למשל, טיהור רעלים) על מנת להבטיח עקביות קונפורמציה בין המון ייצור. <strong > דמוי 5 ו -6 להמחיש את שימוש DSC לבחון את ההשפעות של תנאים דטוקסיפיקציה ומחסני כימיקלי בהתאמה על יציבות קונפורמציה מבנית של שני חלבונים שונים. ההבדלים המשמעותיים ב TM ו ΔH להצביע על שינויי קונפורמציה ושפלת חלבון בהתאמה. בנוסף, אובדן המעבר השלישי באיור 6 נוסף ממחיש את השפלתה של תחום אשר אושר על ידי ירידה במשקל מולקולרי כאשר הדגימות נותחו באמצעות כרומטוגרפיה בגודל הדרה עם פיזור אור רב-זווית (SEC-יונקים) ( מידע לא מוצג). איור 1: סורק הצפה. דמיון השיפוע של כל סריקה ללא פסגות נצפות מציין כי המכשיר נמצא במצב עבודה טוב שנוצר תוצאות לשחזור.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2: נתונים גולמיים שנאספו מניסויי DSC. גרפים אלה הם ייצוגים טובים של נתונים לא המוסברים (גלם) שנרכשו לאחר ריצות ניסיון (קרי בטרם חיסור עקום בסיס הולם). כל שורה מייצגת הרבה ייצור. חלבון 2 נוטה לצבור יותר בקלות על חימום, וכתוצאה מכך עלייה בקיבולת חום מעל 100 מעלות צלזיוס באזור-המעבר פוסט של thermogram. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <br/> איור 3: נתח נתוני DSC. גרפים אלה הם ייצוגים טובים של נתוני DSC נתחו (כלומר, לאחר חיסור מחקר ולאחר עקומה הולמת). הקו הכחול מייצג את thermogram לאחר חיסור בסיס, ואילו הקו האדום מייצג את העקומה עם בכושר הטוב ביותר אל thermogram. (א) T מ 'ΔH עבור חלבון 1 לדוגמא # 12 הם 80.16 ° C ו- 1.69 x 10 6 cal / mol בהתאמה. (ב) מ T ו ΔH עבור חלבון 1 לדוגמא # 13 הם 80.15 ° C ו- 1.71 x 10 6 cal / mol בהתאמה. (ג) T מ 'ΔH עבור חלבון 2 לדוגמא # 21 הם 75.01 ° C ו- 4.08 x 10 6 cal / mol בהתאמה. (ד) מ T ו ΔH עבור חלבון 2 לדוגמא # 22 הם 75.67 ° C ו- 4.22 x 10 6 cal / mol בהתאמה. אנא לחץ כאן כדילצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4: Thermogram Incomplete. נתונים גולמיים לאסוף עבור חלבון 1 ונותח טווח טמפרטורות לקוי. הטמפרטורה הסופית של הניסוי נקבע ל -90 מעלות צלזיוס אשר לא להתאים את פרופיל המעבר כולו של חלבון לעומת הניסוי עבור איור 2 א אשר נקבע ל -120 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5: ניתחו נתונים מראה את ההשפעה של ניקוי רעלים כימיים על מבנה שלישוני של חלבון 1. (א) חלבון 1 הוא רעלן קונפורמציה המקורית שלו ואת חהS M T שלה ב 56.84 מעלות צלזיוס, ΔH ב 2.57 x 10 5 cal / mol. (ב) טופס detoxified של חלבון 1 (toxoid כלומר) יש T מ וערכים ΔH של 81.01 ° C ו- 1.89 x 10 6 cal / mol בהתאמה. לפיכך, ניתן להסיק כי צעד הגמילה הציג צורה כלשהי של וריאציה על קונפורמציה המבני של חלבוני 1 אשר מקנה יציבות רבה יותר (מ T גבוה) בצורת detoxified שלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 6: נתח נתונים מראים את ההשפעה של תנאי אחסון על הקונפורמציה של חלבון 3. גרפים אלו ממחישים את ההשפעה של טמפרטורת אחסון (2 – 8 ° C) על יציבות מבנה שליישונים של פרוחלבון 3 למעלה מ -30 שבועות. T מ וערכים ΔH עבור חלבון 3 בבית (א) 8 וה ה -38 בשבוע (B) של אחסון ניתנים בטבלה 1 להלן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. לִטעוֹם Tm 1 (° C) ΔH 1 (cal / mol) Tm 2 (מעלות צלזיוס) ΔH 2 (cal / mol) Tm 3 (° C) ΔH 3 (cal / mol) חלבון 3 מאוחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 8 שבועות 61.91 1.71 x 10 5 75.54 2.17 x 10 5 90.29 4.17 x 10 5 <tד> חלבון 3 מאוחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 38 שבועות 61.87 1.66 x 10 5 75.18 1.46 x 10 5 90.22 5.76 x 10 5 טבלה 1: TM ו ΔH ערכים עבור חלבון 3 בבית שבוע 8 וה ה -38 של אחסון של 2 – 8 מעלות צלזיוס. למרות ערכי m T בשתי נקודות הזמן דומים, ההבדל בערכי ΔH מציין כי המבנה שליישונים של חלבון 3 נפגם כדי כך בחלוף 30 שבועות בתנאי האחסון שצוין.

Discussion

הליך זה כבר שולב בהצלחת חבילות בדיקת אפיון שונות, כוללים מחקרי יציבות השוואת מוצר ^21. במחקרי יציבות בזמן אמת, DSC משמש כדי לפקח T _מ, כמו גם להעריך את F _א הביולוגי לאורך זמן כדי לקבוע את חיי המדף שלהם. באשר השוואת מוצר, הוא משמש כדי להעריך את ההשפעה של תהליך ושינוי מתקן וכן השפעת צעדי ייצור מפתח על קונפורמציה המבני של המון מיוצר. זה בדרך כלל כולל ההשוואה הישירה של ΔH של הרבה מיוצר למוצר הפנית כאזור המוצר האידיאלי. בנוסף, DSC הוכיחה להיות כלי אנליטי שימושי ללימודי ניסוח מוצר ^37. ה- T _{מ 'של} חלבון מאגרים שונים בריכוזים שונים שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את הניסוח כי ומציע את היציבות ביותרהחלבון.

כדי להבטיח את האמינות של השיטה הזאת ואת האובייקטיביות של תוצאותיה, חשוב לשמור פרמטרי בדיקה עקביים מהריצה לרוץ בתוך אותו המחקר (למשל, מחקר ניסוח חיסון). עם זאת, ההליך יכול להיות שונה כדי להכיל הבדלים בתכונות הפיזיות של חלבונים שונים. דוגמא שינוי שניתן לעשות היא לשנות את קצב הסריקה של הניסוי ^{^38,} ^39. חלבונים כי היו מועדים אגרגטים להרכיב כאשר מחומם נבחנו בקצב סריקה מהיר יותר (למשל, 120 ° C / שעה), כדי למנוע את התרומה של אגרגטים לפרופיל המעבר התרמי, כמו גם סתימה בנימי קלורימטר. ראוי לציין כי סריקת קצב יכול להשפיע על תוצאות ניסוי DSC ^38. התרחבותה של שיא מעבר התרמית נצפתה עם הגדלת שיעורי סריקה בחלק פרוחלבונים; עם זאת, T _{מ 'נשאר} קבוע למדי ^38. יתר על כן, צעדי דיאליזת degassing להכנת מדגם הם גם מאוד קריטיים עבור תוצאות מדויקות ^31. דיאליזה מבטיחה כי ההבדל היחיד בהרכב המדגם למאגר הוא החלבון; וכך, כל עודף החום נספג על ידי המדגם ניתן לייחס קיבולת החום של החלבון. Degassing מבטיחה ניתוח נפח מדויק, כמו אקסטרפולציה של פרמטר תרמודינמי מניחה שאירוע ההתגלגלות מתרחש תחת נפח קבוע ולחץ ^31. החלק לחץ מתמיד של ההנחה היא מוסברת על ידי שמירת לחץ החנקן של מערכת כאמור בסעיף 1.1 של ההליך.

בהשוואה לשיטות אחרות של בקביעת יציבותה של תצורות חלבון כגון מעגלי dichroism (CD) פלואורסצנטי Spectroscopies, DSC מציעה מספר יתרונות בתוך comהגדרה מסחרית לרבות חיסכון בעלויות ובזמן. ראשית, העיצוב adiabatic של קלורימטר סריקה ההפרש מאפשרת מדידה של יציבות תרמית עם דיוק טמפרטורה טובה יותר לעומת מדידות עם מכשור עבור דיסקים CD ו הקרינה Spectroscopies ^6. שנית, בניגוד CD, את הדיוק של נתוני DSC אינו תלוי helicity של החלבון ^{^39,} ^40; עם זאת, CD מספק מידע נוסף על ההתגלגלות של המבנה מהשני, אשר יהיה חינם אל DSC ^41. בנוסף, שמירת לחץ קבוע של מערכת DSC מאפשר לבדיקה עם טווח רחב של טמפרטורות ללא רותחים המדגם; וכך, מגוון רחב של חלבונים ניתן לבדוק על ידי DSC.

בעוד DSC היא גישה מהירה יחסית וישירה כדי לקבוע את יציבות התרמית של תרופות ביולוגיות, זה לא בלי מגבלות. ראשית, הבסיסקו צעד חיסור מציג צורה כלשהי של חוסר עקביות אנושית לתוך ניתוח נתונים הגולמי; וכך, וריאציות בתוצאות ניתן להבחין בין משתמשים שונים. שנית, calorimeters סריקת ההפרש יש מגבלות ריכוז מינימאליות אשר עלול להיות קשה להשיג בקנה מידת ייצור בתפזורת. שלישית, ΔH של denaturation תרמית ההפיכה אינו מוחלט; מה שמרמז על כך נגזר ΔG (אינדיקטור של יציבות חלבון) בתרחישים דומים יכול להיות מטעה. יתר על כן, השיטה מתאימה ביותר דגימות מטוהרות. נוכחות של זיהומים עשויה גם לגרום שינוי T _מ אם קיימת אינטראקציה עם החלבון תחת חקירה, או המראה של מעברי תרמית חדשים אם אין אינטראקציה. במקרה כל תכונות נוספות אלה על thermograms ניתן לייחס בטעות דגימות, ובכך להשפיע על הפרשנות של התוצאות. למרות מגבלות אלה, DSC נשאר שיטה אמינה שיכולה לספק מידע מפורט על התרמודינמית החלבון ה התגלגלות תהליך אם מיושם כהלכה ^42.

לסיכום, DSC מציע יתרון משמעותי ככלי הודעה קונפורמציה למוצרי חיסון הביניים שלהם. שני הפרמטרים, T _מ 'ΔH, שנאספו עבור מערך של הרבה של אותו מוצר יכול להיות הבסיס האמפירי, שניתן להשתמש בהם כדי לבחון את ההשפעה של שינויים בתהליך, ניסוח, ותנאי אחסון על מבנה שלישוני ויציבות של חלבון אנטיגנים נגיפיים ^{^21,} ^43.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

הכותבים הם מאוד אסיר תודה ליוסף מנצ'יני (לשעבר עם GE Healthcare), פאבל Czudec, תומאס קייג (מוגבל Malvern מכשירים) עבור תפקידם ההתקנה וההדרכה על קלורימטר סריקת הפרש, Sasmit Deshmukh וובסטר Magcalas לדיונים שלהם.

Materials

Differential Scanning Calorimeter	Malvern Instruments Ltd	28428948 (Via GE Healthcare)	Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.
Contrad 100	Decon Laboratories Inc	1504	Dilute with water to 20% before use
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate	Canadian Life Science	ML072100	Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used
MicroCal ThermoVac	Malvern Instruments Ltd	N/Ap	provided with the Cap VP DSC
Biosafety cabinet	Labconco	Logic+ – A2	biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation
Slide-A-Lyzer dialysis cassette	Thermo Scientific	66810 or 66380	to equilibrate the sample and buffer

Referencias

Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience. J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).
Watson, E. S., O’Neil, M. J. Differential microcalorimeter. Patent. , (1966).
O’Neill, M. J. The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter. Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).
O’Neil, M. J. Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry. Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).
Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. . Mol. Biol. 6, 7-33 (1975).
Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. Adiabatic differential microcalorimeter. Адиабатический дифференциальный микрокалориметр. , (1970).
Andronikashvili, E. L., et al. Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor. Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), 212-214 (1968).
Andronikashvili, E. L., et al. . Conformational Changes of Biopolymers in Solution. , 171-173 (1973).
Andronikashvili, E. L. Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures. Biofizika. 32 (5), 782-799 (1987).
Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures. Bioquímica. 18 (7), 1180-1186 (1979).
Sturtevant, J. M. Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).
Sturtevant, J. M. Biochemical applications of differential scanning calorimetry. Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).
Jackson, W. M., Brandts, J. F. Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation. Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).
Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin. Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).
Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study. J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).
Privalov, P. L., Potekhin, S. A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).
Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins. Biofizika. 33, 954-961 (1988).
Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations. Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).
Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a., Shnyrov, V. L. Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates. J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).
Oreshkin, E. F., et al. Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating. Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).
Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens. Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).
Jiskoot, W., Daan, C. . Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals. 3, (2005).
Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. A new ultrasensitive scanning calorimeter. Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).
Plotnikov, V. V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
Freire, E. Differential scanning calorimetry. Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology. 40, 191-218 (1995).
Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).
Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor. Bioquímica. 34 (16), 5309-5316 (1995).
Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. The conformational equilibrium of human growth hormone. J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).
Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. Clarification of calorimetric and van’t hoff enthalpies for evaluation of protein transition states. Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).
Privalov, P. L. Microcalorimetry of proteins and their complexes. Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology. 490, 1-39 (2009).
Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (ΔHU). Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).
. Stability testing of new drug substances and products. Guideline, ICH Harmonised Tripartite. 1 (2), (2003).
Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances). Zeitschrift für analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
HÖhne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. . Differential Scanning Calorimetry. , (2003).
Porter, L. L., George, D. R. A thermodynamic definition of protein domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).
Frokjaer, S., Daniel, E. O. Protein drug stability: a formulation challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).
Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).
Chiu, M. H., Elmar, J. P. Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions. J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).
Hirst, J. D., Charles, L. B. Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins. J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).
Kirkitadze, M. D., et al. Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact. Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).
Freire, E., SchÖn, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics. Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).
Wen, J., et al. Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC. J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Durowoju, I. B., Bhandal, K. S., Hu, J., Carpick, B., Kirkitadze, M. Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen. J. Vis. Exp. (121), e55262, doi:10.3791/55262 (2017).