Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Ibrahim B. Durowoju; Kamaljit S. Bhandal; Jian Hu; Bruce Carpick; Marina Kirkitadze

doi:10.3791/55262

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioquímica

Differentiecalorimetrie - Een methode voor het beoordelen van de thermische stabiliteit en conformatie van eiwitantigeen

Published: March 04, 2017

doi:

10.3791/55262

Ibrahim B. Durowoju¹, Kamaljit S. Bhandal¹, Jian Hu¹, Bruce Carpick¹, Marina Kirkitadze¹

¹Analytical Research & Development,Sanofi Pasteur Limited

Summary

Differentiële scanning calorimetrie meet de thermische overgangstemperatuur (s) en de totale warmte-energie nodig is om een eiwit te denatureren. De resultaten worden gebruikt om de thermische stabiliteit van eiwitantigenen beoordelen vaccinformuleringen.

Abstract

Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een analytische techniek die de molaire warmtecapaciteit van monsters als een functie van de temperatuur gemeten. Bij eiwitmonsters, DSC profielen bevatten informatie over thermische stabiliteit, en in zekere mate dient als structurele "vingerafdruk" die kunnen worden gebruikt om structurele conformatie beoordelen. Het is uitgevoerd met een differentiële scanning calorimeter dat de thermische overgangstemperatuur hoogte (smelttemperatuur, _Tm) en de energie die nodig is om de interacties stabiliseert de tertiaire structuur verstoren (enthalpie, AH) van eiwitten. Vergelijkingen worden gemaakt tussen de formuleringen, alsmede de productie veel, en verschillen in de afgeleide waarden geven de verschillen in thermische stabiliteit en structurele conformatie. Gegevens ter illustratie van het gebruik van de DSC in een industriële omgeving voor de stabiliteit studies evenals het toezicht op de belangrijkste stappen in het productieproces worden geleverd als bewijs van de effectiviteit van deze proprotocol. In vergelijking met andere werkwijzen voor het beoordelen van de thermische stabiliteit van eiwitten conformaties, DSC is kosteneffectief, vergt weinig monstervoorbereiding stappen en ook volledig thermodynamische profiel van het eiwit ontvouwingsproces.

Introduction

Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een experimentele methode die direct het verschil in warmte-energie opname plaatsvindt in een monster ten opzichte van een referentie tijdens een geregelde temperatuurverandering ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ^{^8,} ⁹ meet ^, ^{^10,} ^{^11,} ^12. Uitgevoerd in een differentiële scanning calorimeter, omvat de methode het introduceren van warmte-energie in een cel en een referentie-cel tegelijkertijd terwijl identieke verhoging van de temperatuur van beide cellen in de tijd ^{^2,} ^{^13,}14. Vanwege verschillen in de samenstelling van het monster en de referentie worden verschillende hoeveelheid energie nodig om de temperatuur van de cellen ^{^2,} ^{^12,} ¹³ te verhogen. Aldus wordt de overtollige hoeveelheid energie die nodig is ter compensatie van het temperatuurverschil tussen de cellen gemeten en is rechtstreeks gecorreleerd aan specifieke thermodynamische eigenschappen van het monster ^{^1,} ^3.

In de jaren 1960, MJ O'Neil en E. Watson van Perkin Elmer ontwikkelde de eerste differentiële scanning calorimeter de warmtestroom van vaste materialen ^{^2,} ^{^3,} ⁴ meten. Parallel, PL Privalov en DR Monaseldze EL van het Institute of Physics, Republiek Georgië (voormalige Sovjet-Unie) een unieke differentiële adiabatische calorimeter die kunnen worden gebruikt for biochemisch onderzoek ^{^5,} ^6. Vervolgens, team Andronikashvili bij het Institute of Physics, Republiek Georgië, meldde de warmtecapaciteit van biomoleculen zoals vezelachtige en bolvormige eiwitten, DNA en RNA behulp van DSC ^{^7,} ^{^8,} ^9. Verschillende ploegen geleid door Sturtevant ^{^10,} ^{^11,} ^12, ¹³ Brandts en Privalov ^{^14,} ^{^15,} ¹⁶ gericht op de ontwikkeling van de theorie en praktische toepassingen van DSC om de thermodynamische gegevens van eiwitontvouwende onderzoeken. De waarde van DSC bestuderen grote supramoleculaire structuren zoals fagen, chloroplast, fosfolipide vloeibare kristallen, en vlees eiwitten zijn ook gemeld ¹⁷ </ ^sup>, ^{^18,} ^{^19,} ^20.

DSC is nu gemeengoed in farmaceutisch onderzoek en ontwikkeling worden voor de beoordeling van de thermische stabiliteit van biomoleculen, in het bijzonder eiwitten ^{^1,} ^{^21,} ^22. Dit is vooral te wijten aan de vooruitgang in termen van gevoeligheid en automatisering van de instrumenten die worden gebruikt het experiment ^{^23,} ²⁴ uit te voeren. Hier, het eindresultaat van de DSC experiment, namelijk molaire warmtecapaciteit als functie van de temperatuur, wordt gebruikt om de volgende thermodynamische parameters te schatten (verandering warmtecapaciteit (ΔCp), enthalpie (AH), entropie (AS) en Gibbs vrije energie (Ag)) met behulp van de onderstaande vergelijking:

eq1.jpg "/> (1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Waar Cp wordt gemeten warmtecapaciteit; q is de warmtestroom in het testmateriaal; T ₀ en T zijn de eerste en laatste temperaturen van de overgang van respectievelijk ^{^22,} ^25. Het is ook vermeldenswaard dat de vergelijkingen bovenstaande van toepassing op enkel-domein eiwitten die twee-staten-transitie en omkeerbare thermische ontvouwing ²² kan ondergaan. Analyse van meer complexe eiwitten (bijvoorbeeld niet-twee-state eiwitten en oligomeren) have gerapporteerd door Friere et al. ^26; Johnson et al. ^27; en Kasimova et al. ^28.

Om te bepalen of een eiwit ondergaat twee-toestandsovergang of vormt tussenproducten tijdens de thermische denaturatie, het experimenteel afgeleide enthalpie (AH, ook wel calorimetrische enthalpie AH _Cal) vergeleken met de enthalpie verkregen volgens de van't Hoff vergelijking hieronder gegeven (ook genoemd van't Hoff enthalpie, AH _VH):

(6)

Waarbij _Tm is de temperatuur middelpunt van de overgang, R de ideale gasconstante (1,987 cal mol ^-1 K ^-1) en Y de fractie van de eiwitpopulatie in ongevouwen toestand ^{^16,} ^29. AlsAH _VH gelijk aan AH _Cal; of _VH AH / AH _Cal gelijk is aan 1, dan is de proteïne ondergaat een "alles-of-niets" overgang (dat wil zeggen twee-toestandsovergang) ^{^16,} ^{^25,} ^29. Indien AH _VH is dan AH _Cal; of _VH AH / AH _Cal is dan 1, het eiwit ondergaat een niet-two-state overgang ^{^16,} ^{^25,} ^29. De verhouding AH _VH / AH _Cal komt ook overeen met het aandeel van de eiwitstructuur die smelt als thermodynamische coöperatie eenheid of domein ^26.

De thermodynamische parameters zoals hierboven genoemd Ag en AH nuttige informatie over de thermische stabiliteit van eiwitten, waaronder biologische ^30. Toch zal de nadruk worden gelegd op _Tm en de AH in deze publicatie, want zij zijn de gerapporteerde waarden voor dit protocol. _Tm halverwege temperatuur van de overgang, waarbij de gevouwen en ontvouwen toestanden van het eiwit bij evenwicht (dwz Ag = 0) ^{^25,} ^31. Hoe hoger de T _m van een eiwit, hoe hoger de thermische stabiliteit ^31. AH correspondeert met het oppervlak van de piek (en) van de warmtecapaciteit versus temperatuur diagram (ook bekend als thermogram) gegenereerd aan het einde van de DSC experiment ^{^16,} ^25. Het is de energie die nodig is om eiwitten denatureren en kan worden gebruikt om de actieve fractie (F _a) te schatten in een proteïne formulering (dat wil zeggen, het percentage eiwitten met actieve conformatie in een monster) met de volgende vergelijking:

jove_content ">

(7)

Waar AH is de experimenteel afgeleide enthalpie van het eiwit monster en Q de enthalpie bepaald voor een goed gekarakteriseerde referentie- of gestandaardiseerde eiwit ^22. De schatting van F _een significant toezicht op de real-time stabiliteit van producten en uitvoeren stabiliteitsstudies onder stressomstandigheden zoals vereist ICH richtlijnen ^32. Vergelijking van AH geeft ook informatie over de dichtheid van de tertiaire structuur van een eiwit conformatie ^31.

Dit protocol Gegevens een beoordelingsprocedure voor de thermische stabiliteit van eiwitten in een industriële omgeving en is uitgebreid gebruikt voor het formuleren van vaccins. Het werd ontwikkeld met behulp van een geautomatiseerde differentiële scanning calorimeter die reproduceerbare resultaten produceert fof eiwit concentraties van slechts 300 ug / ml.

Protocol

1. Instrument Start-up Schakel de differentiële scanning calorimeter en verhoog de druk in de cellen te koken van de monsters te onderdrukken en de vorming bellen bij verhoogde temperaturen. Dit wordt typisch bereikt door het toevoeren van stikstof in het systeem. Afhankelijk van het samenstellende materiaal van de cel (bijvoorbeeld tantaal, goud, platina, enz.), Pas de druk van het stikstofgas aan conform aanbevolen druk van de fabrikant om beschadiging van de cel. Stel bijvoorbeeld de druk van het stikstofgas voorziening van 45 psi voor gebruikte procedure ontwikkelen instrument en druk boven 80 psi kan de cel beschadigen. Zorgen dat alle reinigingsmiddel reservoirs gevuld tot het gewenste volume. Reinigingsmiddelen vereist onder meer zeep en water om te wassen en reinigen van de cel, respectievelijk na elk monster run. Stel de temperatuur van het monster te houden compartimenteen geschikte waarde, bij voorkeur 5 ° C, om de integriteit van het monster voor experimenteren handhaven. 2. Monstervoorbereiding Dialyseer het monster tegen de buffer die wordt gebruikt als referentie voor het experiment. Alternatief kan elutiebuffer verzameld op de laatste stap van eiwitzuivering (dwz kolom elutie) worden gebruikt. Bepaal de concentratie van het eiwit monster met de meest geschikte eiwitconcentratie bepalingsmethode zoals Kjedahl methode 33 of Lowry methode 34. Voor een objectieve vergelijking van de resultaten, maken gebruik van dezelfde methode consequent binnen dezelfde studie. De vereiste concentratie kan variëren afhankelijk van het model van het instrument. Voor de in dit protocol gebruikte instrument, de voorkeur werkbereik is 0,5-1 mg / ml. Ontgas het monster en referentie buffer in vacuüm ontdoen van microbellen dat volume inaccur kunnen veroorzakenacy. Deze stap kan worden overgeslagen voor nieuwere modellen calorimeter. Met behulp van een micropipet en steriele tips in een laminaire stroming biocontainment kast, laadt de monsters en hun respectieve buffer in paren in 96 putjesplaten compatibel met het instrument. Vul de eerste twee paar putten met buffer en de laatste twee paren met water voor de buffer-buffer en het water scan respectievelijk. Buffer-buffer scans controleren of de geschiktheid van het instrument voorafgaand aan de meting (dat wil zeggen de beoordeling van instrumentatie fout) te proeven, evenals de oprichting van een basislijn; terwijl water scans worden uitgevoerd om de cellen te reinigen. Bedek de 96-well plaat met een afdichtende film, en ervoor te zorgen dat de putten goed zijn afgedicht voordat de plaat uit de bioveiligheid kabinet om het monster te voorkomen. Plaats de plaat in de steekproef houden compartiment in de juiste richting. 3. Experimenteel Parameter Setup Opmerking: Afhankelijk van de instrumentation monsters kunnen worden geladen in de cel ofwel handmatig met een injectiespuit of automatisch met behulp van een autosampler. In dit geval is (dwz een industriële omgeving), wordt een autosampler gebruikt om tijd te besparen. Met behulp van de acquisitie software, voert het monster informatie in de volgorde van de plaat werd volgens paragraaf 2.4 geladen. Voer concentraties indien beschikbaar, anders, voer concentratiewaarden in analysesoftware voorafgaand aan de data-analyse (paragraaf 4.2). Selecteer de optie dat het reinigen van cellen met detergent zorgt voor elk monster-scan, die moet worden gevolgd door meerdere water spoelen stappen om geen wasmiddel residuen in de cellen te waarborgen. Stel de starttemperatuur van het experiment met 20 ° C, maar dit kan variëren afhankelijk van voorkennis van het monster. Voor bekende eiwitten, kunnen vooraf bepaalde begintemperatuur worden gebruikt, terwijl een lagere uitgangstemperatuur kunnen worden toegepast onbekende monsters. Stel de uiteindelijke temperatuurvan het experiment, bijvoorbeeld 100 ° C. De eindtemperatuur variabel voorkennis van het monster. Stel de scansnelheid van het experiment, bijvoorbeeld 60 ° C / h, wat typisch scansnelheid. Evenwel scansnelheid variabel voorkennis van het monster, bijvoorbeeld 90 ° C / h of 120 ° C / h. Het is raadzaam om onbekende monsters met verschillende scansnelheden scannen naar de kinetiek van ontvouwen beoordelen. Rescan monsters naar de omkeerbaarheid van de thermische ontvouwing te onderzoeken. Het ontvouwen van een eiwit wordt als reversibel indien het resultaat voor de tweede scan enthalpie ten minste 80% van de enthalpie waarde van de eerste scan. Stel de post-experiment thermostaat op 10 ° C om de integriteit van de cellen calorimeter te behouden. Controleer of het experiment setup parameters juist vóór de uitvoering van het experiment zijn. Als alles op zijn plaats is, start het experiment. 4. Gegevens Analysis Ophalen ruwe gegevens uit het experiment en selecteer een monster bij een tijd voor analyse. Aftrekken verwijzing scan, dwz buffer, uit het monster scan. LET OP: Reference aftrekken wordt automatisch door nieuwere modellen van DSC-instrumenten uitgevoerd. Voer sample concentratie waarde als het werd weggelaten volgens paragraaf 3.1. Passen en aftrekken van de basislijn verkregen thermogram om rekening te houden met verschillen in de warmtecapaciteiten van de gevouwen en ontvouwen toestanden van het eiwit dat wordt veroorzaakt door de blootstelling van hydrofobe groepen op water ontvouwen. Lineaire of derdegraads kromme fitting kan worden toegepast, afhankelijk van de vorm van het profiel DSC voor het monster. Voor consistentie, hetzelfde type fitting tijdens een onderzoek, bijvoorbeeld real-time stabiliteitsstudie te gebruiken. Deze stap is nodig om de curve werkwijze voor piekintegratie om enthalpie van transitie verkrijgen. Piekintegratie voeren met behulp van niet-lineaire kleinste kwadraten. Op basis van productkennis toe te passen twee-staten of niet-twee-staten-model. Twee-staten-model kan worden gebruikt voor enkele coöperatieve thermische overgangen, en voor onbekende eiwitten, gelden de niet-twee state model tot nader kennis van de producten is beschikbaar. Indien van toepassing, aan te passen curve fitting met de iteratieve curve fitting functie van de software van de apparatuur totdat de Chi-kwadraat waarde constant blijft. Verkregen resultaten worden de waarden weergegeven voor middelpunt van transitietemperaturen (Tm), calorimetrische enthalpie (AH) en van't Hoff enthalpie (AH VH) van het monster.

Representative Results

De ruwe gegevens van de meeste DSC experimenten worden gepresenteerd als een warmtestroom tegen temperatuur grafiek, de calorimeter daadwerkelijk meet het verschil in de snelheid van de warmtestroom in de monsteroplossing en buffer 35. Daarom, als beide cellen (dwz monster en referentie-cellen) tijdens een experiment identieke oplossingen bevatten, de ruwe data van de scan moet een vlakke lijn zonder waarneembare pieken zijn. Elke piek waargenomen kan worden toegeschreven aan instrumentatie fout (bijvoorbeeld beschadigde of besmette cellen), dat is waarom loopt buffer scans voorafgaand aan de proeven van de analyse is een adequaat systeem geschiktheidsonderzoek. Figuur 1 toont het resultaat van een typische buffer scan aangeeft dat de calorimeter was in goede conditie voorafgaand aan monsteranalyse. Figuur 2 toont de ruwe gegevens voor een DSC experiment uitgevoerd op diffErent tal van twee eiwit monsters. Zoals eerder gesuggereerd, de waargenomen pieken zijn de verschillen in de warmteflux van de monsters en hun respectieve buffers. Verschillen in sample concentratie kan variaties in warmtecapaciteit geregistreerd door de calorimeter veroorzaken; maar deze variaties zijn genormaliseerd tijdens monsteranalyse zoals in Sectie 4.2 van de procedure. Hogere concentraties kunnen ook zien extra thermodynamische domeinen niet bijdragen tot de overgang bij lagere concentraties. Bovendien, elke overgang is een thermodynamische domein dat kan één of meer structurele domeinen van het eiwit 36. In dit geval Protein 1 drie structurele domeinen die gezamenlijk smelten. Figuur 3 toont de resultaten die uit de analyse van de ruwe gegevens voor eiwit 1 en 2 weergegeven in figuur 2, dat wil zeggen, na aftrekken van de basislijn en iteratieve curve fitting. De resulterende thermogrammen zijn genormaliseerd voor het scannen van snelheid en concentratie (automatisch uitgevoerd door een vooraf ingestelde algoritme in de analyse software wordt uitgevoerd); aldus, waarin de resultaten van het experiment in vergelijkbare warmtecapaciteit versus temperatuur grafieken. De analysesoftware gebruikt gegevens van de warmtecapaciteit versus temperatuur grafieken, zoals Tm en ΔCp, andere thermodynamische parameters in varianten van de bovenstaande vergelijkingen afhankelijk van het coöperatief vermogen van eiwitontvouwende gegeven ontlenen. Bij het testen van onbekende monsters, het instellen van de juiste temperatuur is van cruciaal belang. Anders kunnen onvolledig thermogrammen leiden, zie figuur 4. Hoewel Tm van dergelijke profielen kunnen worden afgeleid, AH kan niet nauwkeurig worden vastgesteld. Daarom moet het monster opnieuw getest met een groter temperatuurbereik van de thermische overgang volledig vangen. Sommige eiwitten re ookadily vorm aggregaten na volledige denaturatie, waardoor steeds na overgang warmtecapaciteit: Dit verschijnt vaak als een onvolledige thermogram zie figuur 2B. Echter, nacontrole met een hogere eindtemperatuur kan helpen bevestigen of er een optreden van een conformationele overgang bij dat gebied van de thermogram en het is slechts de warmte-absorberende effect van eiwit-aggregaten. Thermische stabiliteit is één van de belangrijkste fysische eigenschappen van eiwitten en eiwit gebaseerde producten in de industrie 37. In farmaceutische producten, wordt het gebruikt om de stabiliteit van biologische bepaling onder verschillende omstandigheden, eventueel formulering buffers en omgevingsfactoren zoals luchtvochtigheid en temperatuur. Het wordt ook gebruikt ter observatie van vervaardigingsstap (bijvoorbeeld zuivering en ontgifting) conformationele samenhang tussen productiepartijen waarborgen. <strong > Figuren 5 en 6 illustreren de toepassing van DSC om de effecten van chemische ontgifting en bewaaromstandigheden bestuderen, respectievelijk op de stabiliteit en structurele conformatie van twee verschillende eiwitten. De aanzienlijke verschillen in Tm en AH geven conformatieveranderingen en eiwitafbraak respectievelijk. Bovendien, het verlies van de derde overgang in Figuur 6 illustreert verder de afbraak van een domein dat werd bevestigd door een afname in molecuulgewicht wanneer de monsters werden geanalyseerd onder toepassing Grootte-uitsluitingschromatografie met multi-angle lichtverstrooiing (SEC-MALS) ( data niet weergegeven). Figuur 1: Buffer Scans. De gelijkenis in gradiënt van elke scan zonder waarneembare pieken geeft aan dat het instrument is in goede staat en genereerden reproduceerbare resultaten.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Raw Data verzameld van DSC experimenten. Deze grafieken zijn een goede vertegenwoordiging van de niet-geanalyseerde (rauw) verworven na experimentele runs gegevens (dwz voorafgaand aan de baseline aftrekken en curve fitting). Elke lijn staat voor een productie veel. Protein 2 neigt gemakkelijker aggregeren bij verhitting, waardoor een verhoging warmtecapaciteit boven 100 ° C in de post-overgangsgebied van het thermogram. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. <br/> Figuur 3: geanalyseerde DSC gegevens. Deze grafieken zijn een goede vertegenwoordiging van de geanalyseerde DSC gegevens (dwz na het aftrekken van de basislijn en curve fitting). De blauwe lijn geeft de thermogram na het aftrekken van de basislijn, terwijl de rode lijn van de curve met de beste fit aan de thermogram vertegenwoordigt. (A) De Tm en de AH voor eiwit 1 Monster # 12 zijn 80,16 ° C en 1,69 x 10 6 cal / mol resp. (B) De Tm en de AH voor eiwit 1 Monster # 13 zijn 80,15 ° C en 1,71 x 10 6 cal / mol resp. (C) De Tm en de AH voor eiwit 2 Monster # 21 zijn 75,01 ° C en 4,08 x 10 6 cal / mol resp. (D) De Tm en de AH voor eiwit 2 Monster # 22 zijn 75,67 ° C en 4,22 x 10 6 cal / mol resp. Klik hier ombekijk een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: Een onvolledige Thermogram. Ruwe data te verzamelen voor Protein 1 geanalyseerd bij onvoldoende temperatuurbereik. De eindtemperatuur van experiment werd ingesteld op 90 ° C, die niet de gehele overgangsprofiel van het eiwit niet geschikt ten opzichte van het experiment Figuur 2A werd ingesteld op 120 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: geanalyseerde gegevens die het effect van chemische ontgifting op de tertiaire structuur van proteïne 1 (A) Protein 1 is een toxine in zijn natieve conformatie en has zijn T m bij 56,84 ° C en AH op 2,57 x 10 5 cal / mol. (B) De ontgifte vorm van Protein 1 (dwz toxoïde) heeft Tm en AH waarden van 81,01 ° C en 1,89 x 10 6 cal / mol resp. Derhalve kan worden geconcludeerd dat de detoxificatie stap heeft enkele vorm van wijziging in de structurele conformatie van Protein 1 die een grotere stabiliteit (hogere Tm) zijn gezuiverde vorm verleent. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: geanalyseerde gegevens die het effect van bewaaromstandigheden op de conformatie van proteïne 3. Deze grafieken tonen het effect van de bewaartemperatuur (2-8 ° C) op de stabiliteit en tertiaire structuur van ProTein 3 meer dan 30 weken. De Tm en de AH waarden voor eiwit 3 op de 8e (A) en 38 ste week (B) opslagruimte zijn in Tabel 1 hieronder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Monster 1 Tm (° C) AH 1 (cal / mol) 2 Tm (° C) AH 2 (cal / mol) 3 Tm (° C) AH 3 (cal / mol) Eiwit 3 bij 2-8 ° C gedurende 8 weken 61,91 1.71 x 10 5 75,54 2.17 x 10 5 90.29 4.17 x 10 5 <td> Protein 3 bewaard bij 2-8 ° C gedurende 38 weken 61,87 1,66 x 10 5 75,18 1,46 x 10 5 90,22 5,76 x 10 5 Tabel 1: Tm en AH waarden voor eiwit 3 op de 8e en 38e week opslag bij 2-8 ° C. Hoewel de Tm-waarden aan beide tijdstippen zijn gelijk, het verschil in de AH waarden geeft aan dat de tertiaire structuur van proteïne 3 dan 30 weken afgebroken onder de gespecificeerde bewaarcondities.

Discussion

Deze procedure is met succes opgenomen in verschillende karakterisering testpakketten, waaronder de stabiliteit en de vergelijkbaarheid studies ^21. Realtime stabiliteitsstudies wordt gebruikt om de DSC _Tm bewaken, alsmede een schatting van de _Fa van biologische tijd om hun houdbaarheid te bepalen. Met betrekking tot de vergelijkbaarheid wordt gebruikt om de impact van de werkwijze en inrichting verandering en het effect van belangrijke vervaardigingsstappen op de structurele conformatie van geproduceerde partijen beoordelen. Dit omvat normaliter de directe vergelijking van de AH van geproduceerde partij een referentie product dat is aangewezen als het ideale product. Bovendien heeft DSC bewezen een analysemiddel voor product formuleringsstudies ³⁷ zijn. De _Tm van een eiwit in verschillende buffers met verschillende concentraties kan worden gebruikt om de formulering die de stabiliteit te bepalen proffershet eiwit.

Om de betrouwbaarheid van deze methode en objectiviteit van de resultaten, is het belangrijk om testparameters consistent van gang tot gang in dezelfde studie (bv vaccinpreparaat studie). Echter, de procedure worden gewijzigd om verschillen in de fysische eigenschappen van verschillende eiwitten tegemoet. Een voorbeeld van een modificatie die gemaakt kan worden is het veranderen van de scansnelheid van het experiment ^{^38,} ^39. Eiwitten die gevoelig zijn voor de vorming van aggregaten waren toen verwarmd werden sneller scansnelheid onderzocht (bijvoorbeeld 120 ° C / h) de bijdrage van aggregaten voor de thermische overgangsprofiel voorkomen en verstopping van de capillairen van de calorimeter. Het is vermeldenswaard dat het scannen van snelheid de uitkomst van een DSC experiment ³⁸ kunnen beïnvloeden. Verbreding van de thermische overgangstemperatuur piek waargenomen met toenemende scansnelheden in sommige proeiwitten; echter, T _m bleef redelijk constant ^38. Bovendien is de dialyse en ontgassen stappen voor de bereiding van de monsters zijn ook zeer belangrijk voor nauwkeurige resultaten ^31. Dialyse zorgt dat het enige verschil in de samenstelling van het monster en de buffer het eiwit; Aldus kan de overtollige warmte wordt geabsorbeerd door het monster worden toegeschreven aan de warmtecapaciteit van het eiwit. Ontgassing garandeert juiste omvang analyse, zoals de extrapolatie van de thermodynamische parameters neemt aan dat het ontvouwen gebeurtenis zich voordoet onder druk en constant volume ^31. De constante druk gedeelte van de veronderstelling komt voor rekening van stikstof onder druk van het systeem als in punt 1.1 van de procedure.

In vergelijking met andere werkwijzen voor het bepalen van de stabiliteit van eiwitconformaties zoals Circulaire dichroïsme (CD) en fluorescentie spectroscopie, DSC biedt een aantal voordelen in een comcommerciële instelling met inbegrip van kosten en tijd te besparen. Enerzijds het adiabatische ontwerp van een differentiële scanning calorimeter maakt het meten van de thermische stabiliteit betere temperatuurregeling precisie vergeleken met metingen met instrumentatie voor CD en fluorescentie spectroscopie ^6. Ten tweede, in tegenstelling tot CD, de nauwkeurigheid van DSC gegevens zijn niet afhankelijk van de heliciteit van de eiwitten ^{^39,} ^40; echter CD biedt aanvullende informatie over het ontvouwen van de secundaire structuur, die complementair zijn aan de DSC ⁴¹ zou zijn. Bovendien, het onder druk zetten van de DSC systeem kunnen getest met een breed temperatuurbereik zonder verwarmen het monster; Aldus kan een groot aantal eiwitten worden getest door DSC.

Terwijl DSC is een relatief snelle en eenvoudige benadering van de thermische stabiliteit van biologische bepaling is niet zonder beperkingen. Ten eerste, de basislijn aftrekken stap introduceert een vorm van menselijke inconsequentie in de ruwe data-analyse; aldus kunnen verschillen in de resultaten worden waargenomen bij verschillende gebruikers. Ten tweede, differentiële scanning calorimeters hebben minimale concentratie grenzen die moeilijk te realiseren bij massaproductie schaal zou kunnen zijn. Ten derde, de AH van irreversibele thermische denaturatie is niet absoluut; hetgeen impliceert dat afgeleid Ag (een indicator van eiwitstabiliteit) in soortgelijke scenario misleidend kan zijn. Bovendien heeft de werkwijze het beste werkt voor gezuiverde monsters. Aanwezigheid van onzuiverheden kan ofwel leiden tot een verschuiving in de _Tm of er een interactie met het eiwit te onderzoeken, of het uiterlijk van nieuwe thermische transities als er geen interactie. In ieder geval deze extra functies op de thermogrammen verkeerd kan worden toegeschreven aan monsters, waardoor de interpretatie van de resultaten beïnvloeden. Ondanks deze beperkingen DSC blijft een betrouwbare methode die gedetailleerde thermodynamische Inform kunnen biedene eiwitontvouwende proces indien goed ⁴² geïmplementeerd.

Concluderend DSC biedt aanzienlijke voordelen als een conformationeel uitlezing instrument vaccinproducten en hun tussenproducten. De twee parameters, _Tm en AH, verzameld voor een reeks van veel hetzelfde product kan een empirische basislijn die kan worden gebruikt om het effect van procesveranderingen, formulering en bewaaromstandigheden op de tertiaire structuur en stabiliteit van eiwitten onderzocht worden en virale antigenen ^{^21,} ^43.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs zijn zeer dankbaar voor Joseph Mancini (voorheen met GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments beperkte) voor hun rol in de installatie en training op de differentiële scanning calorimeter, Sasmit Deshmukh en Webster Magcalas voor hun discussies.

Materials

Differential Scanning Calorimeter	Malvern Instruments Ltd	28428948 (Via GE Healthcare)	Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.
Contrad 100	Decon Laboratories Inc	1504	Dilute with water to 20% before use
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate	Canadian Life Science	ML072100	Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used
MicroCal ThermoVac	Malvern Instruments Ltd	N/Ap	provided with the Cap VP DSC
Biosafety cabinet	Labconco	Logic+ – A2	biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation
Slide-A-Lyzer dialysis cassette	Thermo Scientific	66810 or 66380	to equilibrate the sample and buffer

Referencias

Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience. J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).
Watson, E. S., O’Neil, M. J. Differential microcalorimeter. Patent. , (1966).
O’Neill, M. J. The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter. Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).
O’Neil, M. J. Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry. Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).
Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. . Mol. Biol. 6, 7-33 (1975).
Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. Adiabatic differential microcalorimeter. Адиабатический дифференциальный микрокалориметр. , (1970).
Andronikashvili, E. L., et al. Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor. Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), 212-214 (1968).
Andronikashvili, E. L., et al. . Conformational Changes of Biopolymers in Solution. , 171-173 (1973).
Andronikashvili, E. L. Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures. Biofizika. 32 (5), 782-799 (1987).
Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures. Bioquímica. 18 (7), 1180-1186 (1979).
Sturtevant, J. M. Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).
Sturtevant, J. M. Biochemical applications of differential scanning calorimetry. Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).
Jackson, W. M., Brandts, J. F. Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation. Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).
Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin. Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).
Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study. J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).
Privalov, P. L., Potekhin, S. A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).
Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins. Biofizika. 33, 954-961 (1988).
Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations. Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).
Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a., Shnyrov, V. L. Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates. J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).
Oreshkin, E. F., et al. Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating. Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).
Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens. Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).
Jiskoot, W., Daan, C. . Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals. 3, (2005).
Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. A new ultrasensitive scanning calorimeter. Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).
Plotnikov, V. V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
Freire, E. Differential scanning calorimetry. Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology. 40, 191-218 (1995).
Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).
Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor. Bioquímica. 34 (16), 5309-5316 (1995).
Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. The conformational equilibrium of human growth hormone. J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).
Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. Clarification of calorimetric and van’t hoff enthalpies for evaluation of protein transition states. Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).
Privalov, P. L. Microcalorimetry of proteins and their complexes. Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology. 490, 1-39 (2009).
Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (ΔHU). Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).
. Stability testing of new drug substances and products. Guideline, ICH Harmonised Tripartite. 1 (2), (2003).
Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances). Zeitschrift für analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
HÖhne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. . Differential Scanning Calorimetry. , (2003).
Porter, L. L., George, D. R. A thermodynamic definition of protein domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).
Frokjaer, S., Daniel, E. O. Protein drug stability: a formulation challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).
Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).
Chiu, M. H., Elmar, J. P. Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions. J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).
Hirst, J. D., Charles, L. B. Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins. J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).
Kirkitadze, M. D., et al. Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact. Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).
Freire, E., SchÖn, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics. Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).
Wen, J., et al. Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC. J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Durowoju, I. B., Bhandal, K. S., Hu, J., Carpick, B., Kirkitadze, M. Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen. J. Vis. Exp. (121), e55262, doi:10.3791/55262 (2017).