差示扫描量热 - 用于评估蛋白质抗原的热稳定性和构象的方法

从最DSC实验的原始数据表示为一个热通量与温度图，作为量热计实际测量热流到样品溶液的速率的差异和缓冲器35。因此，如果两个小区（ 即样品和参考细胞）的实验期间包含相同的解决方案，从扫描的原始数据应与没有观察到峰的扁平线。观察到的任何峰可以归因于仪器错误（ 例如 ，损坏或污染的细胞），这是为什么运行缓冲扫描样品之前分析是足够的系统适用性试验。 图1示出指示该量热计在样品分析前良好的工作状态的典型缓冲扫描的结果。 图2显示了差异为的DSC实验的原始数据进行erent很多两条蛋白样品。如前面暗示，观察到的峰是在样品和它们各自的缓冲区的热通量的差异。在样品浓度的差异可引起由热量计记录的热容量的变动;但是，这些变化是样品分析按程序的第4.2节中归一化。更高的浓度也可以显示其他的热力学结构域在较低浓度没有贡献的过渡。此外，每个过渡表示热力学域可包括蛋白质36的一个或多个结构域。在这种情况下，蛋白1具有熔融协同三个结构域。 图3示出了从蛋白1和2在图2中， 即呈现的原始数据的分析所产生的结果，基线减法和迭代曲线音响后拟合。所得热分析已归一扫描速率和浓度（自动在分析软件预先设定的算法进行）;因此，呈现的实验的结果中可比较的热容量对温度的曲线图。分析软件从热容量对温度的图，如T 微米 ΔCp使用数据，以得到使用取决于蛋白质的折叠的协同上面给出的方程的变化等热力学参数。 当测试未知样品，设置适当的温度范围内是至关重要的。否则，不完整的热分析可能导致，如在图4中示出。虽然由这种配置的Tm可以得出，ΔH不能准确地确定。因此，样品必须具有较大的温度范围内进行复检完全捕获热转变。一些蛋白质也重新完全变性后adily形式聚集，导致增加过渡后的热容量： 如图2B所示的本常表现为不完整的热分析图。然而，具有较高的最终温度复检可以帮助确认是否有在热分析的该区域的构象转变的发生或它仅仅是蛋白质聚集体的热吸收效果。 热稳定性是在行业37的蛋白质和蛋白质基的产品的最显著物理性能之一。在医药品，它是用来确定不同的条件，包括配制剂缓冲液和环境因素，如湿度和温度下生物制剂的稳定性。它也可以用来监控关键制造步骤（ 例如，纯化和解毒），以确保生产批次之间的构象的一致性。 <strong >图5和6示出了使用的DSC分别以审查的稳定性和两种不同的蛋白质的结构构象的化学解毒和储存条件效果。在Tm和ΔH的显著差异分别表示的构象变化和蛋白质降解。另外，在图6中的第三过渡的损失进一步示出了通过在分子量降低证实当样品用大小排阻层析用多角度光散射（SEC-MALS）进行分析的域的降解（数据未示出）。 图1：缓冲扫描。在没有观察到峰每次扫描的梯度相似性表明仪器处于良好的工作状态，并产生重复的结果。//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。 图2：原始数据从DSC实验收集。这些图是实验运行后获得的未分析（原始）数据（ 即前基线扣除和曲线拟合）良好的表现。每一行代表一个生产批次。蛋白2趋于在加热时更容易地聚集，从而在热分析的后过渡区域的增加在100℃以上的热容量。 请点击此处查看该图的放大版本。 <br/> 图3：DSC分析数据。这些图表进行分析DSC数据的良好表现（基线扣除和曲线拟合后， 即 ）。蓝线代表基线减法之后的温谱图，而红线代表最佳配合到温谱图的曲线。 （一）蛋白质1样品＃12 的Tm和ΔH是80.16°C和1.69×10 6千卡/摩尔分别。 （B）的T M和ΔH蛋白质1样品＃13是80.15°C和1.71×10 6千卡/摩尔分别。 （C）蛋白质2样品＃21 的Tm和ΔH是75.01°C和4.08×10 6千卡/摩尔分别。 （D）Tm 值和ΔH蛋白质2样品＃22 75.67°C和4.22×10 6千卡/摩尔分别。 请点击此处查看该图的放大版本。 图4：不完整的热像图。原始数据收集在一个温度范围内充分分析蛋白1。实验的最终温度设定为90℃相比，实验用于图2A将其设定为120℃，这并没有容纳该蛋白质的整个过渡轮廓。 请点击此处查看该图的放大版本。 图5：分析数据显示化工解毒之功效蛋白质1（A）蛋白1 的三级结构是其天然构象和毒素公顷■在56.84℃，它的T M和ΔH在2.57×10 5千卡/摩尔。 （B）蛋白1（ 即类毒素）的解毒形式分别是T M和81.01的℃，ΔH值和1.89×10 6千卡/摩尔。因此，可以得出结论，在解毒步骤中引入某种形式的变化，以蛋白1的结构构象，其赋予更大的稳定性（较高的Tm）至其去毒的形式。 请点击此处查看该图的放大版本。 图6：分析的数据显示储存条件的影响3.蛋白的构象这些图表说明储存温度的影响（2 – 8°C）的稳定性和专业三级结构3 TEIN超过30周。 Tm 值和在第 8（A）的蛋白3和存储的38 个星期（B）的 ΔH值在下面的表1中给出。 请点击此处查看该图的放大版本。 样品 的Tm 1（℃） ΔH1（卡/摩尔） 的Tm 2（℃） ΔH2（卡/摩尔） Tm为3（℃） ΔH3（卡/摩尔） 蛋白3保存在2-8°C，持续8周 61.91 1.71×10 5个 75.54 2.17×10 5个 90.29 4.17×10 5个 <td>蛋白3保存在2-8℃下38周 61.87 1.66×10 5个 75.18 1.46×10 5个 90.22 5.76×10 5个 表1：Tm和ΔH值蛋白3在凌晨2存储8 日和38 日周- 8°C。虽然在这两个时间点的的Tm值是相似的，在ΔH值的差异表明，蛋白质3的三级结构已指定的储存条件下劣化超过30周。