Sublimering av DAN Matrix for søking og visualisering av gangliosider i Rat hjernevev for MALDI Imaging massespektrometri

Matriks-assistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) Imaging massespektrometri (IMS) er blitt en svært ettertraktet teknikk for visualisering av den romlige fordelingen av lipider, peptider og proteiner på tvers av intakte prøvenes overflater. MALDI IMS var tidligere kjent som en analytisk teknikk for pre-renset analytter, men i de senere år, har det vært å trekke oppmerksomhet i mange andre disipliner på grunn av evnen til å kombinere nøyaktigheten av massespektroskopi med høy oppløsning visuelle / anatomiske referansepunkter uten trenger for eksterne merking. Som den vitenskapelige pool av forskere som benytter denne teknikken fortsetter å vokse, er det økt behov for standardiserte, lett-å-følge protokoller for å bistå i utvikling og optimalisering av IMS eksperimenter. Gangliosider, en gruppe av membranlipider svært tallrike i sentralnervesystemet, er ideelle for MALDI IMS eksperimenter som sin beliggenhet, integrert i membranen, gjør enkelte spesies umulig å oppdage ved hjelp av konvensjonelle Immuno-merking. I tillegg har vi vist, ved hjelp av MALDI IMS, at disse lipider, som virker som modulatorer av cellesignalisering, blant annet har unike anatomisk fordelingsmønstre i det friske gnager hjernen som er endret etter hjerneskade ^{3, 4, 5.} Gangliosider er plassert på et høyere masseområde sammenlignet med de fleste arter lipid, og er derfor mest egnet for den MALDI bildeplattformen.

Figur 1: Workflow av MALDI IMS Experiment. Diagram av den generelle arbeidsflyten av en MALDI IMS eksperiment ved hjelp sublimering. Vev frosset ved -80 ° C er delt i en cryostat og 10 um delene er tine montert på ledende ITO lysbilder. Raset er deretter plassert i et tørke til sublimering. Slides er satt inn i sublimeringsapparatet og et jevnt lag av matrise påføres på vevsprøve overflate. Prøver blir frosset over natten i en -20 ° C fryser deretter plassert i en eksikator i 10 min. Når standarder har blitt påført, blir prøvene satt inn i MALDI instrument hvor en laser er rettet på tvers av vev forårsaker desorberte molekyler i grunnmassen for å ionisere. Ionene reise ned et fly rør og separat basert på deres masse (time-of-flight / TOF) til de når detektoren. Informasjonen om den ioniske overflod av analytter innenfor en forutbestemt masse-til-ladning (m / z) område er vist som både en molekyl bilde og massespektrum. Denne informasjonen kan brukes til både å visualisere og kvantifisere den ioniske overflod av analytten av interesse innenfor det avbildede vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

prøveopparbeidelsefor MALDI IMS er svært variabel som hvert trinn i prosessen må tilpasses til de analyttene av interesse. Den definerende trekk ved MALDI-baserte forsøk er bruken av en matrise belegg avsatt på prøvens overflate før analyse. I tillegg til rollen til å absorbere og overføre strålingsenergi fra laseren under avsmeltingsprosessen, matrisen tjener også til å isolere forskjellige analytter fra prøven, for derved å lette analysen av forbindelser av interesse ^{6, 7.} Homogen påføring av matriksen til prøveoverflaten er den mest avgjørende trinn i prøveprepareringsprosessen. Feilaktig matrise deponering kan føre til store heterogene matrise krystallformasjoner og utvikling av gjenstander, lav ion-signal, og dårlig reproduserbarhet ^7.

På grunn av affiniteten av enkelte matriser for å isolere bestemte analytter, typen av matriks er valgt for et eksperiment muligvesentlig endre utfallet. Matrisene som benyttes for avbildning av proteiner og peptider ofte avviker fra de som brukes for avbildning lipider og prosessen blir ytterligere komplisert ved behovet for ytterligere prosedyrer slik som vasking og rehydrering trinnene i for å kunne detektere signaler fra vev. Selv om vasketrinnene finnes for forbedring av lipid-signaler ^{til 8,} er de ikke en forutsetning for påvisning av de lipid-arter. Ved valg av en matrise for en lipid avbildning eksperiment, er det viktig å ta hensyn til polariteten av lipid av interesse, da dette vil begrense omfanget av egnede matriser. For eksempel gangliosidene inneholde sialinsyrerester som gir dem en samlet negativ polaritet. Det finnes en rekke matriser som effektivt kan desorbere og ioniserer gangliosider fra vev; må imidlertid faktorer som matrise-avledet topper i spekteret og stabiliteten av matrisen under vakuum tas under overveielse. 1,5-diaminonapthalene (DAN) matrise er tilstrekkelig stabil under instrument vakuumbetingelser for de fleste av bildebehandlingsapplikasjoner og har vist en høy grad av følsomhet for lipid desorpsjon og kan anvendes for analyse av lipider i både positive og negative ion-modus ^2. DAN matriks, sammenlignet med andre negative lipid affinitetsmatrikser som dihydroksybenzosyre (DHB), 9-aminoacridine (9-AA), og 5-klor-2-merkaptobenzotiazol (CMBT), var i stand til å mest effektivt desorbere gangliosider fra rottehjerne vev i negativ ion-modus (manuskript under forberedelse).

Velge den riktige metoden for matrise deponering er like viktig å velge selve matrisen. Våte matrise avsetningsmetoder, karakterisert ved at den faste matriks er oppløst i et organisk oppløsningsmiddel, og er satt inn av pneumatisk eller automatiserte spredere eller spotters, er spesielt effektive for desorpsjon av proteiner og peptider som væsken syrer prøven for å gi ekstraDette skjer av forbindelser og ko-krystallisering med matrisen. Selv om disse teknikker kan også brukes til lipid applikasjoner, analytt delokalisering og ujevn matrisekrystallformasjoner er vanlige forekomster på grunn av den høye overflod og oppløselighet av lipider i oppløsningsmidler, spesielt i vev ^{2, 9.} Fordi lipider blir lett ioniseres fra vev, tørre matriseavsetningsteknikker, slik som destillasjon, gir en enkel, kostnadseffektivt alternativ til spredere mens omgå mange av ulempen med disse teknikkene. Suksessen til sublimering i MALDI IMS eksperimenter er knyttet til funksjoner som for eksempel mikrokrystallinsk grunnmasse morfologi som øker overflatearealet for matrise-analytt binding, økt matrise renhet, og homogen matrise avsetning fører til økt reproduserbarhet sammenlignet med våte matrise teknikker ^{1, 10.}

sublime~~POS=TRUNC involves oppvarming av en pulverformig matrise under vakuum, umiddelbart under en avkjølt prøve overflate som resulterer i faststoff til gass-fase overgang av det pulverformige matrise fulgt av avsetning på den vevsprøve overflate. Under sublimering, kan matriseavsetning kontrolleres ved å variere faktorer som tid, temperatur og trykk for å tilveiebringe svært reproduserbare resultater. En enkelt sublime eksperiment kan ta alt fra 5 til 20 min avhengig av typen av matriks er valgt, som kan brukes om igjen flere ganger før de kastes. Apparatet kan kjøpes kommersielt til en brøkdel av prisen av automatiserte sprøyter og er lett tas fra hverandre for rengjøring og vedlikehold. De lave kostnadene og relativ enkelhet i denne matrisen deponering teknikken gjør det ideelt for forskere som begynner eller utvide på lipid bildebehandlingsprogrammer i MALDI IMS. Selv informasjon detaljering protokoller for sublimering av vev for IMS har blitt rapportert ^11, noen få standardiserte protokoller finnes wjør fokusere på den grunnleggende arbeidsflyten som er involvert med å gjennomføre en sublimeringseksperiment for å avbilde høye masse lipider i negativ ion-modus, noe som gjør det vanskelig å etablere teknikken uten utstrakt prøving og feiling. Følgende er en eksperimentell protokoll som mål å fylle dette gapet for sublimering av DAN matrise på rottehjerne seksjoner for høy oppløsning og påvisning av gangliosider.

Figur 2: Sublime Apparatus. Bilde (A) og koblingsskjema (B) av sublimering anordningen. Vakuumpumpen er forbundet med gummislangen til en kald felle fylt med 300 ml etanol. Den kalde felle blir deretter forbundet ved hjelp av gummislangen til sublime anordningen. Anordningen består av to separate stykker av glass som er forseglet sammen med et metall universalledd. Den øverste halvdelen av sublimatorinneholder kondensatoren som er fylt med is slaps. Prøven platen er tapet på bunnen av kondensatoren inne i forseglet glassapparaturen. Den nederste halvdelen av sublime apparatet inneholder DAN matrise, spredt jevnt mot prøven plate. Under sublimering blir glassapparaturen plassert på et sandbad oppvarmet til 140 ° C med en varm plate direkte under den. Temperatursonden bidrar til å opprettholde en stabil temperatur gjennom hele forsøket sublime gjennom tilbakemelding av sandbadet temperatur sammenlignet med den forhåndsinnstilte temperaturen for forsøket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.