Сублимация DAN Матрицы для обнаружения и визуализации ганглиозидов в Rat ткани головного мозга для MALDI масс-спектрометрии изображений

Матричный с лазерной десорбцией / ионизацией (MALDI) обработки изображений Масс-спектрометрия (IMS), становится большим спросом техники для визуализации пространственного распределения липидов, белков и пептидов через интактные поверхности образцов. MALDI IMS ранее был известен как аналитический метод для предочищенного аналитов, но в последние годы, было привлечение внимания во многих других дисциплинах, из-за способности сочетать точность масс-спектрометрии с высокой разрешающей способностью визуальных / анатомических ориентиров без потребность в любой внешней маркировки. Как научный пул исследователей, использующих эту технику продолжает расти, наблюдается повышенная потребность в стандартизированных, простых в последующих протоколов для содействия в разработке и оптимизации экспериментов IMS. Ганглиозиды, группа мембранных липидов высоко обильными в центральной нервной системе, идеально подходят для экспериментов MALDI IMS, в качестве местоположения, внедренного внутри мембраны, делает определенную специфичнуюэс невозможно обнаружить с помощью обычного иммуно-маркировки. Кроме того, мы показали, с помощью MALDI IMS, что эти липиды, которые функционируют в качестве модуляторов клеточной сигнализации, помимо всего прочего, имеют уникальные шаблоны анатомического распределения в здоровом мозге грызунов, которые измененном после травмы головного мозга ^{3, 4, 5.} Ганглиозиды расположены на более высоком диапазоне масс по сравнению с большинством видов липидных, и, таким образом, наиболее подходит для платформы MALDI визуализации.

Рисунок 1: Технологическая схема MALDI IMS эксперимента. Схема общего рабочего процесса из эксперимента MALDI IMS с помощью сублимации. Ткань замораживают при температуре -80 ° C подразделен в криостат и 10 мкм секции оттепели смонтированы на токопроводящих ITO слайдами. Ползун не затем помещают в эксикатор до сублимации. Sliдез вставляются в сублимационного аппарата и даже слой матрицы наносят на поверхности образца ткани. Образцы замораживают в течение ночи в морозильной камере C -20 ° затем помещают в эксикатор на 10 мин. После того, как стандарты были применены образцы вставляются в MALDI инструмент, где лазер направлен поперек ткани, вызывая десорбирующихся молекул в матрице ионизировать. Эти ионы движутся вниз полета трубки и отдельной основе их массы (время пролета / TOF), пока они не достигают детектора. Информация о ионном обилие аналитов в пределах заданной массы к заряду (m / z) Диапазон отображается и как молекулярного изображения и масс-спектра. Эти данные могут быть использованы для обоих визуализации и количественного определения ионной обилие интерес аналита в пределах изображаемого ткани. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Базовые приготовлениядля MALDI IMS сильно варьирует, как каждый шаг процесса должен быть настроен на интерес аналитов. Отличительная особенность экспериментов MALDI основе является использование матричного покрытия, нанесенного на поверхность образца до анализа. В дополнение к роли поглощения и передачи энергии излучения от лазера во время процесса абляции, матрица также служит для изоляции различных аналитов из пробы, таким образом , облегчая анализ соединений , представляющих интерес ^{6, 7.} Однородная применение матрицы к поверхности образца является наиболее важным шагом в процессе подготовки образца. Неправильное нанесение матрицы может привести к большим гетерогенными матрица кристаллических образований и развития артефактов, низкий уровень ионного сигнала, и плохой воспроизводимости ^7.

Из-за сродства некоторых матриц для выделения конкретных аналитов, тип матрицы выбран для эксперимента можетсущественно изменить результат. Матрицы, используемые для визуализации белков и пептидов, часто отличаются от тех, которые используются для работы с изображениями и липидов процесс осложняется еще и необходимостью дополнительных процедур, таких как стиральные и регидратации шаги для того, чтобы успешно обнаруживать сигналы от ткани. Несмотря на то, стадии промывания существуют для повышения липидных сигналов ^8, они не являются предпосылкой для обнаружения большинства видов липидов. При выборе матрицы для эксперимента липидный визуализации, важно учитывать полярность липидного интереса, так как это будет сузить диапазон подходящих матриц. Например, ганглиозиды содержат остатки сиаловой кислоты, которые дают им общую отрицательную полярность. Есть целый ряд матриц, которые могут эффективно десорбируют и ионизируют ганглиозидов из ткани; Тем не менее, такие факторы, как матрица полученных пиков в спектре и стабильность матрицы в вакууме должны быть приняты при рассмотрении. 1,5-diaminonapthalene (DМатрица АН) является достаточно стабильным в приборных условиях вакуума для большинства приложений для обработки изображений и продемонстрировал высокую степень чувствительности к липидной десорбцией и могут быть использованы для анализа липидов в положительных и отрицательных мод ионных ^2. матрица DAN, по сравнению с другими матрицами отрицательным сродством липид, такой как дигидроксибензойной кислоты (DHB), 9-аминоакридин (9-АА), и 5-хлор-2-меркаптобензотиазола (CMBT), был в состоянии наиболее эффективно десорбируют ганглиозидов из мозга крысы ткани в режиме отрицательных ионов (рукопись в стадии подготовки).

Выбор соответствующего метода осаждения матрицы имеет равное значение выбору самой матрицы. Мокрые способы осаждения матрицы, в котором твердую матрицу, растворяют в органическом растворителе, и осажденные пневматическим или автоматизированные опрыскиватели или корректировщиков, являются особенно эффективными для десорбции белков и пептидов, как жидкость пропитывает образец, чтобы учесть дополнительныйфикция соединений и совместной кристаллизации с матрицей. Хотя эти методы могут быть также использованы для липидных приложений, аналит делокализации и неравномерным матричных кристаллических образований являются обычным явлением из – за высокой численности и растворимости липидов в растворителях, в частности в ткани ^{2, 9.} Поскольку липиды легко ионизируется из ткани, сухие методы осаждения матрицы, такие как сублимация, предлагают простой и экономически эффективной альтернативой опрыскивателей в обход многих Недостаток этих методов. Успех сублимации в экспериментах MALDI IMS объясняется такими функциями, как морфология микрокристаллическая матрицы , что увеличивает площадь поверхности для матрицы-аналита связывания, повышенной чистоты матрицы и однородного осаждения матрицы приводит к увеличению воспроизводимости по сравнению с мокрыми методами матричных ^{1, 10.}

Сублимация INVOLVES нагрева порошкообразного матрицу под вакуумом непосредственно ниже охлаждаемой поверхности образца, что приводит к твердый газофазовому перехода порошкового матрицы с последующим осаждением на поверхность образца ткани. В процессе возгонки, осаждение матрицы можно регулировать путем изменения факторов, таких как время, температура и давление, чтобы обеспечить высокую воспроизводимость результатов. Один эксперимент сублимации может занять от 5 до 20 мин в зависимости от типа матрицы, выбранной, которые могут быть повторно использованы несколько раз перед утилизацией. Устройство может быть закуплен на долю от стоимости автоматических распылителей и легко демонтирована для очистки и обслуживания. Низкая стоимость и относительная простота этого метода осаждения матрицы делают его идеальным для исследователей начала или расширяющихся на липидный приложений визуализации в MALDI IMS. Хотя информация подробно протоколы для возгонки тканей для IMS было зарегистрировано ^11, несколько стандартизированные протоколы существуют шHICH сосредоточиться на основной рабочий процесс связан с проведением эксперимента сублимации для визуализации больших масс липидов в режиме отрицательных ионов, что делает его трудно установить технику без обширных проб и ошибок. Ниже приведен экспериментальный протокол с целью восполнить этот пробел для сублимации матрицы DAN на участках мозга крыс для изображения с высоким разрешением и обнаружения ганглиозидов.

Рисунок 2: Устройство сублимации. Фотография (А) и схематическое изображение (В) сублимационного аппарата. Вакуумный насос соединен с помощью резиновой трубки к холодной ловушке, заполненной 300 мл этанола. Охлаждаемая ловушка затем соединяется с помощью резиновой трубки к сублимации аппарата. Устройство состоит из двух отдельных частей изделий из стекла, которые герметично соединены вместе с помощью металлического U-соединения. Верхняя половина сублиматорсодержит конденсатор, который заполняется ледяной каше. Образец пластина приклеенный на дно конденсатора, внутри герметизированного стекла аппарата. Нижняя половина сублимации аппарата содержит матрицу DAN, раскинувшийся равномерно сталкивается образец пластины. Во время сублимации, при этом устройство из стекла помещают на песчаную баню, нагретую до 140 ° С с помощью нагревательной плиты непосредственно под ним. Датчик температуры помогает поддерживать стабильную температуру в течение всего эксперимента сублимации через обратную связь температуры песчаной бани по сравнению с заданной температурой для эксперимента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.