טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים
Summary
We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.
Abstract
טיהור חלבונים פעילים ומכלולים חומצות גרעין חלבון חיוני לאפיון של פעילות אנזימטית ו דה נובו זיהוי של יחידות משנה רומן שלאחר translational שינויים. מערכות בקטריאלי לאפשר ביטוי וטיהור של מגוון רחב של פוליפפטידים יחיד קומפלקסי חלבונים. עם זאת, מערכת זו אינה מאפשרת טיהור של יחידות משנה חלבון המכילים שלאחר translational שינויים (למשל, זירחון acetylation), ואת ההזדהות של יחידות משנה הרגולציה רומן כי הם רק בהווה / הביעו במערכת איקריוטיים. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של רומן, חזק, וטיהור זיקת טנדם יעילה (TAP) שיטה באמצעות STREP- וחלבונים מתויג FLAG המאפשר הטיהור של קומפלקסי חלבונים עם זמני או ביציבות הביע-tagged חלבוני epitope מתאי איקריוטיים. ניתן ליישם פרוטוקול זה לאפיין protein פונקציונליות מורכבות, לגלות שלאחר translational שינויים על יחידות משנה מורכבות, ולזהות רכיבים מורכבים רגולטוריות רומן על ידי ספקטרומטריית מסה. יש לציין, שיטת TAP זה ניתן להחיל ללמוד קומפלקסי חלבונים שהוקמו על ידי איקריוטיים או פתוגניים (נגיפיים וחיידקיים) רכיבים, ובכך מניב מגוון רחב של הזדמנויות ניסיון במורד זרם. אנו מציעים כי חוקרי עובדים עם קומפלקסי חלבונים יכולים לנצל גישה זו בדרכים רבות ושונות.
Introduction
אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) הן קריטיות להסדרה המדויקת של תהליכים ביולוגיים 1, ומחקרים נוספים על PPIs אלה יכולים להודיע על תפקידם 2. גישות כמה כבר המציאו לחקר ואפיון של PPI כמו גם לזיהוי דה נובו של רכיבי חלבון הרגולציה הרומן. בשנת 1989, סטנלי פילדס ועמיתיו דיווחו על השנייה היברידי השמרים (Y2H) assay 3. גישה זו מאפשרת זיהוי המשוחדת ומקיפה של interactors (פושט) עבור חלבון מוגדר של עניין (פיתיון) ב שמר אפייה. בנוסף השירות המדהים שלה לגילוי PPIs, assay Y2H יכול לשמש לאפיון זוגות חלבון בתאי שמרים, הגדרה מינימאלי תחומי אינטראקציה, וזיהוי מוטציות לבטל אינטראקציות כאלה. על ידי שינוי assay Y2H, PPIs יכול להיות גם למד בתאי יונקיםclass = "Xref"> 4. וריאציות של assay Y2H (למשל, מערכת תלת-היברידית שמרים) יכול להיות מיושם גם ללמוד חלבון-רנ"א אינטראקציות ליגנד אורגני-קטן חלבונים בתאים.
כלי נוסף נפוץ ללמוד PPIs במערכת הומולוגית הוא immunoprecipitation שיתוף (שיתוף IP) assay 5. באמצעות נוגדן כדי immunoprecipitate חלבון של עניין, assay שיתוף IP מאפשר לחוקרים לעקוב אחר PPIs בתאים עבור תנאים סביבתיים שונים ומצבים ניסיוניים. השימוש-tagged חלבונים epitope (למשל, דגל, Myc, סטרפטוקוקוס, ו HA, בין היתר) טיהור זיקה (AP) שיטות יש להקל את הבידוד של חלבונים מתערובות חלבון מורכב במשך כמה מבחני במורד הזרם, כולל כתם המערבי, כתם כסף , וניתוח האנזימטית. עם זאת, אף אחד הגישות הקודמות אלה מאפשרים הבידוד של כמויות גדולות של קומפלקסי חלבונים עבור אפיון נוסף כולל במבחנהssays, גילוי יחידות משנת רגולציה על ידי ספקטרומטריית מסה, וזיהוי שלאחר translational שינויים. גרסה משופרת של שיטת AP נקראת טנדם AP (TAP), שהיא טכניקת טיהור ללימוד PPIs על ידי יצירת חלבון היתוך עם שני אפיטופים כי הוא מטוהר באמצעות שתי נקודות גישה עוקבות 6, 7. במאמר זה, אנו מציגים וריאציה של שיטת TAP עבור קומפלקסי חלבוני טיהור שבו שתי תת יחידות מתויגות עם אפיטופים שונים וטהרו מכן דרך שתי נקודות גישה סדרתית (סטרפטוקוקוס AP ואחריו FLAG IP). אנחנו ראשונים לספק סקירה מינימליסטי של TAP (איור 1) ולאחר מכן תיאור מפורט של כל שלבי הניסוי (איור 2), כך חוקרים יכולים ליישם אותם על מורכבות עניין החלבון שלהם.
כדי להדגים את תחולתה של שיטת TAP, בחרנו היטב מאופיין cyclin-CDK מורכב (המכונה PTEFB קינאז), אשר מורכב של T1 cyclin למקטע רגולטוריות (CycT1) ו קינאז (CDK9), והוא מעורב בוויסות שעתוק על ידי RNA פולימראז II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb phosphorylates תחום מסוף-C של Pol II וגורם ההתארכות השלילית הקשורות אליו, ובכך יקל שהשהיה תעתיק בבית האמרגן ובכך מקלת התארכות שעתוק 11, 12, 13. עם אינטראקציה ידועה זה בחשבון, סטרפטוקוקוס-מתויג CycT1 ו CDK9 מתויג FLAG היה מעל לידי ביטוי בתאי HEK293T. ניסוי TAP גומלין בוצע עם FLAG-מתויג CDK9 ו מתויג סטרפטוקוקוס CycT1 לאמת נוסף שאינטראקצית החלבון היא עצמאית של אפיטופים מנוצלים. תאים נאספו lysed 48 transfection שעות שלאחר. את lysate המסיס היה מטוהר על ידי TAP (סטרפטוקוקוס AP ואחריו FLAGIP). קלט חלבונים מטוהרים נותחו על ידי כתם המערבי כתם כסף (איור 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן לביטוי והבידוד של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים אינו מוגבל באפיון ביוכימי של מכלולים מולקולריים כזה, אבל יכול גם להיות מנוצל לצורך זיהוי של interactors רומן שלאחר translational שינויים שיכולים לווסת את תפקידם. הניצול של תגי קרבה אינו מוגבל למה מוזכר בפ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D’Orso.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30022FS | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher Scientific | MP091670049 | |
| PolyJet | Fisher Scientific | 50-478-8 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | SLBQ1981V | |
| Corning 100mm × 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Fisher Scientific | 13-698-794 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
Referencias
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
- Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
- Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
- Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
- McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D’Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
- D’Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
- McNamara, R. P., Bacon, C. W., D’Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
- Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
- McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
- Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
- Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).
