La estimulación de la señalización de Notch en el ratón osteoclastos precursores

La vía de señalización Notch de mamífero es homóloga a la misma vía en Drosophila melanogaster y consta de cuatro receptores transmembrana muesca (Notch1-4) y cinco ligandos unidos a la membrana del Jagged (JAG1 y JAG2) y Delta-como (DLL1, 3, y 4) las familias ^1. La señalización de Notch se inicia cuando el receptor Notch en una célula receptora está obligado por ligando en una célula de transmisión ^2. Durante este trans-activación, el ligando Notch unida a la membrana produce una fuerza de estiramiento sobre el receptor Notch unida a la membrana ^{3, 4.} La fuerza de estiramiento de ligando de unión induce cambios conformacionales en el receptor Notch que facilitan la escisión extracelular del receptor de TNF por la enzima de conversión (TACE), seguido de un evento de escisión intracelular mediada por una gamma-secretasa complejo (γ-secretasa) que contiene la presenilina. comunicados de γ-secretasa la int Notchdominio racellular (NICD), que se transloca al núcleo donde se forma un complejo de activación de la transcripción con CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), mastermind-como (MAML), y los factores específicos del tipo de células para dirigir la expresión de los genes objetivo ^5.

Los elementos mecánicos del resultado de la activación de la señalización de Notch en la necesidad de métodos únicos de activación de la vía de Notch in vitro. ligandos Notch solubles pueden unirse a Notch receptores, pero no producir fuerzas de estiramiento necesarias para la liberación NICD mientras que al mismo tiempo competitivamente inhibir la unión de ligandos de Notch asociados a células. Por lo tanto, la adición de ligandos de Notch solubles al medio de cultivo puede atenuar normal de señalización ^{6, 7} Notch. Afortunadamente, los ligandos de Notch pueden inducir la liberación de NICD si se fijan a un sustrato rígido apropiado ^{5, 8, 9,10.} La siembra de células sobre sustratos de cultivo ligando recubiertos o la aplicación de perlas de ligando recubierto a las células puede tanto activar la señalización de Notch, y la elección entre ellos depende principalmente de la temporización deseada de estimulación Notch. Para la activación de señalización Notch inmediata y temporal, como sería deseado durante el punto medio de un ensayo funcional o la diferenciación, el ligando de Notch se puede unir a perlas de agarosa, aplicados a las células cultivadas, y se lavó a cabo en cualquier momento. Para obtener más señalización Notch sostenido desde el comienzo de un periodo de cultivo, placas de cultivo de tejido se pueden recubrir con el ligando antes de la siembra de células.

Para los fines de este protocolo, los métodos se llevan a cabo utilizando precursores de osteoclastos de ratón, pero los métodos y variaciones de los métodos descritos aquí son aplicables a una amplia variedad de tipos de células ^{6, 11, 12, 13,} </sup> ^14. Los osteoclastos son células terminalmente diferenciadas linage hematopoyéticas que son responsables de la resorción del tejido óseo, y que están implicadas en varios trastornos de pérdida ósea ^15. Por lo tanto, es el estudio in vitro de la diferenciación de los osteoclastos a partir de sus precursores de monocitos / macrófagos linaje y los mecanismos moleculares que controlan su función es esencial para la mejor comprensión de los osteoclastos y desarrollo de nuevas terapias de regeneración de hueso. A pesar de que ahora se acepta generalmente que la señalización Notch desempeña un papel positivo en la diferenciación y función de los osteoclastos, las variaciones en la estimulación tanto de señalización Notch y la cultura de los osteoclastos precursores y la diferenciación condujeron a resultados contradictorios inicialmente ^{16, 17, 18, 19.} Un examen más detallado de las diferencias en los métodos y el uso de los recursos genéticosmodelos han aclarado en gran medida el papel de la señalización Notch en la osteoclastogénesis, pero la aplicación de métodos de estimulación y cultura Notch estandarizados podrían prevenir este tipo de controversias en futuros estudios de señalización Notch en otros tipos de células ^{20, 21, 22, 23.}

Existen múltiples métodos para el cultivo y la diferenciación de precursores de osteoclastos de ratón, y, como con diferentes métodos para estimular la señalización de Notch, el mejor método dependerá de la pregunta experimental. En este documento, se presentará nuestro método preferido de cultivo fracciones adherentes y no adherentes de células de la médula ELIMINADOS de los huesos largos del ratón. Este método tiene la ventaja de requerir esencialmente ningún equipo especializado y la producción de células que son aplicables a una variedad de métodos de diferenciación.