Estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento dei gangli dorsali nei roditori
Summary
Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.
Abstract
Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.
Introduction
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di isolare il midollo spinale e per identificare e isolare DRG 1, 2. Estrusione idraulica del midollo spinale è un metodo molto più veloce rispetto al modo tradizionale di isolamento del midollo spinale per laminectomia, cioè rompendo vertebre spinali uno alla volta, e questo metodo riduce il rischio di danni ai tessuti causati dal processo di dissezione 3, 4 . DRG può essere difficile da individuare. La corretta identificazione è molto importante per l'analisi dei tessuti, ad esempio in seguito lesione del nervo sciatico. Numerando i DRG in base alla loro localizzazione rispetto al costae, DRG possono essere identificati in modo coerente.
Tissue isolato mediante tecniche dimostrate qui può essere applicato ad un'ampia gamma di analisi inclusi occidentale blotting 5,6, 7 e qPCR colorazione immunoistochimica 8.
Nell'individuazione DRG, è importante prendere in considerazione che il numero dei segmenti spinali si caratterizza per variare con il tipo di animale e ceppo 9, 10, 11. I vantaggi di eseguire questo metodo nei topi sono l'elevato numero di varianti geneticamente modificati disponibili e le spese relativamente basse abitazioni. I vantaggi nell'utilizzo di ratti sono la resa dei tessuti relativamente alta e se coinvolge lesioni nervose, la procedura sarà facilitato con dimensioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se la colonna vertebrale è disturbato, ad esempio mediante dislocazione cervicale, il midollo spinale dividerà durante l'estrusione. Se il midollo spinale non può essere estruso, la colonna spinale può essere leggermente tagliati a entrambe le estremità e il tentativo di estrusione può essere ripetuto. Nel caso sia necessario l'intero midollo spinale per ulteriori analisi, cioè costituito dell'allargamento cervicale e l'allargamento lombare della colonna vertebrale deve essere tagliato solo leggermente. Se è necessario solo il rigonfiamento lombare per ulteriori analisi, il midollo spinale deve essere tagliato secondo la presente protocollo. La colonna vertebrale deve essere raddrizzata con la punta delle dita per facilitare l'estrusione.
Il protocollo è applicabile ai roditori di ogni età ed è qui esemplificato da un topo adulto (8 settimane), un cucciolo mouse (5 giorni) e un ratto adulto (10 settimane). A seconda del tipo di animale e la tensione, il numero di sezioni toracica e lombare può variare 9, </sup> 10, 11. A seconda delle proteine da analizzare, roditori adulti possono essere perfusi con soluzioni di enzimi inibizione prima dell'eutanasia. Se si esegue un esperimento che coinvolge lesioni nervose unilaterale, il midollo spinale può essere suddiviso in parti ipsilaterale e controlaterale utilizzando pinzette ultrafini subito dopo l'estrusione. Inoltre, ogni lato può essere suddiviso in dorsale e ventrale lati. Il tessuto può quindi essere elaborato per ulteriori analisi, ad esempio Western blotting.
Transcardial perfusione-fissazione con PFA prima dell'estrusione del midollo spinale dovrebbe essere evitata, in quanto rende il midollo spinale non flessibile e impedisce midollo spinale estrusione idraulica. Idraulico estrusione del midollo spinale si strappa le radici dorsali. Per gli esperimenti in cui sono necessari allegati radici dorsali, si consiglia di laminectomia. Inoltre, meningi spinali vengono persi per estrusione idraulico, che può essere evitato laminectomia serie <sup class = "xref"> 3.
estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento DRG potrebbe anche essere eseguita utilizzando ossigenato liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) invece di PBS ghiacciato. L'uso di ACSF permette conservazione del tessuto isolato in un ambiente migliore fisiologica, che è particolarmente importante nel caso di successive registrazioni elettrofisiologiche 12, 13. Un'alternativa al ACSF potrebbe essere PBS contenente 1 g / L di glucosio per la generazione di colture DRG primaria 14.
estrusione idraulica del midollo spinale è un metodo molto più veloce rispetto al modo tradizionale di isolamento del midollo spinale per laminectomia, riducendo i tempi di tessuto-movimentazione e quindi diminuendo il rischio di danni proteine. Perfusione con un fissatore prima di isolare il midollo spinale laminectomia può ridurre il rischio di danni ai tessuti durante la dissezione e durante la rimozione finale delmidollo spinale dalla colonna vertebrale. Tuttavia, la fissazione dei tessuti preclude l'applicabilità di analisi come la Western blotting. I rendimenti di estrusione idraulici tessuto strutturalmente integro 3 adatto per una gamma più ampia di analisi.
individuazione coerente di DRG può essere difficile. Tuttavia, questo è essenziale per l'analisi dei tessuti, ad esempio in seguito lesione del nervo sciatico. Numerando i DRG in base alla loro localizzazione rispetto al costae, DRG possono essere identificati in modo coerente. La colorazione di tessuto del midollo spinale e della DRG può essere ottimizzata eseguendo le variazioni di trattamento del tessuto illustrate descritte nel passaggio 7 di protocollo.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience – DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.
Materials
| Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
| Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
| Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
| Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
| Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 % | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
| Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
| Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
| Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
| Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
| Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
| Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| Pipette tip, 1-200 μl, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
| Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
| Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
| Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
| Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
| Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
| Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
| Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
| TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |
Referencias
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