Este trabajo describe métodos para establecer modelos de hiperglucemia aguda y crónica en el pez cebra. El objetivo es investigar el impacto de la hiperglucemia sobre los procesos fisiológicos, tales como la neurogénesis constitutiva y la inducida por lesión. El trabajo también destaca el uso de pez cebra para seguir moléculas radiomarcadas (aquí, [ 18 F] -FDG) utilizando PET / CT.
La hiperglucemia es un problema de salud importante que conduce a la disfunción cardiovascular y cerebral. Por ejemplo, se asocia con un aumento de los problemas neurológicos después del accidente cerebrovascular y se muestra que perjudica los procesos neurogénicos. Curiosamente, el pez cebra adulto ha emergido recientemente como un modelo relevante y útil para imitar la hiperglucemia / diabetes y para investigar la neurogénesis constitutiva y regenerativa. Este trabajo proporciona métodos para desarrollar modelos de hiperfeminismo de pez cebra para explorar el impacto de la hiperglucemia en la proliferación de células cerebrales bajo condiciones homeostáticas y de reparación cerebral. La hiperglucemia aguda se establece mediante la inyección intraperitoneal de D-glucosa (2,5 g / kg de peso corporal) en el pez cebra adulto. La hiperglucemia crónica se induce por inmersión de pez cebra adulto en D-glucosa (111 mM) que contiene agua durante 14 días. Se describen mediciones de nivel de glucosa en la sangre para estos diferentes enfoques. Métodos para investigar el impacto de la hiperglucemia sobreY la neurogénesis regenerativa, mediante la descripción de la lesión mecánica del telencéfalo, la disección del cerebro, la inclusión de parafina y la sección con un microtomo, y la realización de procedimientos inmunohistoquímicos. Finalmente, se describe también el método de utilizar el pez cebra como modelo relevante para estudiar la biodistribución de moléculas radiomarcadas (aquí, [18F] -FDG) utilizando PET / CT.
La hiperglucemia se define como niveles excesivos de glucosa en la sangre. A pesar de que podría reflejar una situación de estrés agudo, la hiperglicemia es también una condición que a menudo conduce a un diagnóstico de diabetes, un trastorno crónico de la secreción de insulina y / o resistencia. En 2016, el número de adultos que viven con diabetes ha alcanzado 422 millones en todo el mundo, y cada año, 1,5 millones de personas mueren de esta enfermedad, por lo que es un problema de salud importante 1 . De hecho, la diabetes no controlada conduce a varios trastornos fisiológicos que afectan al sistema cardiovascular, a los riñones y al sistema nervioso periférico y central.
Curiosamente, la hiperglucemia aguda y crónica puede alterar la cognición y contribuir a la demencia y la depresión 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Además, la admisión de pacientes wLa hiperglicemia se ha asociado con peores resultados funcionales, neurológicos y de supervivencia después del accidente cerebrovascular isquémico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . También se demostró que la hiperglucemia / diabetes afecta la neurogénesis de adultos, un proceso que conduce a la generación de nuevas neuronas, por el impacto de la actividad de las células madre neurales y la diferenciación neuronal, la migración y la supervivencia [ 2 , 12] .
En contraste con los mamíferos, los peces teleósteos, como el pez cebra, muestran una intensa actividad neurogénica en todo el cerebro y muestran una capacidad excepcional para la reparación del cerebro durante la edad adulta 13 , 14 , 15 , 16 . Cabe destacar que estas capacidades son posibles debido a la persistencia de neuRal / células progenitoras, incluyendo glia radial y neuroblastos [ 17 , 18 , 19] . Además, el pez cebra ha surgido recientemente como un modelo para estudiar los trastornos metabólicos, incluyendo obesidad e hiperglucemia / diabetes 20 , 21 , 22 .
Aunque el pez cebra es un modelo bien reconocido de hiperglucemia y neurogénesis, pocos estudios han investigado el impacto de la hiperglucemia sobre la homeostasis del cerebro y la función cognitiva 12 , 23 . Para determinar el impacto de la hiperglucemia sobre la proliferación de células cerebrales constitutivas y lesionadas, se creó un modelo de hiperglucemia aguda mediante la inyección intraperitoneal de D-glucosa. Además, se reprodujo un modelo de hiperglucemia crónica a través de la inmersión de peces en agua suplementada wCon D-glucosa 12 . Zebrafish exhiben muchas ventajas en la investigación. Son baratos, fáciles de levantar y transparentes durante las primeras etapas de desarrollo, y su genoma ha sido secuenciado. En el contexto de este trabajo, también muestran varias ventajas adicionales: (1) comparten procesos fisiológicos similares con los humanos, haciéndolos una herramienta crítica para la investigación biomédica; (2) permiten una rápida investigación del impacto de la hiperglucemia sobre la homeostasis del cerebro y la neurogénesis, dada su amplia y fuerte actividad neurogénica; Y (3) son un modelo alternativo, que permite la reducción del número de mamíferos utilizados en la investigación. Finalmente, el pez cebra puede usarse como un modelo para probar la biodistribución de moléculas radiomarcadas y agentes terapéuticos potenciales usando PET / CT.
El objetivo general del siguiente procedimiento es visualizar visualmente cómo configurar modelos de hiperglucemia aguda y crónica en el pez cebra, use zebRafish para evaluar la remodelación cerebral en condiciones hiperglucémicas y monitorear las moléculas radiomarcadas (aquí, [ 18 F] -FDG) utilizando PET / CT.
Este trabajo describe varios métodos para establecer modelos agudos y crónicos de hiperglucemia en el pez cebra. Las principales ventajas de estos procedimientos son: (1) permitir una reducción en el número de mamíferos utilizados para la investigación, (2) son fáciles de configurar y de implementar rápidamente, y (3) son económicos. Por lo tanto, estos modelos permiten investigar el impacto de la hiperglucemia en un gran número de animales para estudiar su impacto en diferentes procesos fisiológicos, incluye…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a la Dirección de Usos del Número (DUN) de la Universidad de la Reunión por editar el video (en particular Jean-François Février, Eric Esnault y Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan por la voz en off, Mary Osborne-Pellegrin por la corrección de pruebas La voz en off, y la plataforma CYROI. Este trabajo contó con el apoyo de becas de la Universidad de La Reunión, del Consejo Régional de la Reunión, de la Unión Europea (CPER / FEDER) y de la asociación Philancia. ACD es becario del Ministerio de Educación Nacional, de la Enseñement Supérieur et de la Recherche, de la Universidad de la Reunión (Contrat Doctoral).
1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm x 13 mm | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
Fish Strain | AB | ||
Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |