Modelos agudos e crônicos de hiperglicemia no peixe-zebra: um método para avaliar o impacto da hiperglicemia na neurogênese e a biodisponibilidade das moléculas radiomarcadas
Summary
Este trabalho descreve métodos para estabelecer modelos de hiperglicemia aguda e crônica no peixe-zebra. O objetivo é investigar o impacto da hiperglicemia em processos fisiológicos, como a neurogênese constitutiva e induzida por lesão. O trabalho também destaca o uso de peixe zebra para seguir moléculas radiomarcadas (aqui, [ 18 F] -FDG) usando PET / CT.
Abstract
A hiperglicemia é um importante problema de saúde que leva à disfunção cardiovascular e cerebral. Por exemplo, está associado a problemas neurológicos aumentados após o AVC e é mostrado que prejudica os processos neurogênicos. Curiosamente, o peixe-zebra adulto surgiu recentemente como um modelo relevante e útil para imitar a hiperglicemia / diabetes e investigar a neurogênese constitutiva e regenerativa. Este trabalho fornece métodos para desenvolver modelos de hipertensão do peixe-zebra para explorar o impacto da hiperglicemia na proliferação de células cerebrais sob condições de reparação homeostática e cerebral. A hiperglicemia aguda é estabelecida usando a injeção intraperitoneal de D-glucose (2,5 g / kg de peso corporal) em peixe zebra adulto. A hiperglicemia crônica é induzida por imersão de peixe zebra adulto em D-glucose (111 mM) contendo água por 14 dias. As medidas do nível de glicose no sangue são descritas para essas diferentes abordagens. Métodos para investigar o impacto da hiperglicemia na constitutiva aE a neurogênese regenerativa, descrevendo a lesão mecânica do telencefalo, dissecando o cérebro, encaixando parafina e seccionando com um micrótomo, e realizando procedimentos de imuno-histoquímica, são demonstrados. Finalmente, o método de utilização do peixe zebra como modelo relevante para o estudo da biodistribuição de moléculas radiomarcadas (aqui, [ 18 F] -FDG), utilizando PET / CT também é descrito.
Introduction
A hiperglicemia é definida como níveis excessivos de glicose no sangue. Embora possa refletir uma situação de estresse agudo, a hiperglicemia também é uma condição que muitas vezes leva a um diagnóstico de diabetes, uma doença crônica da secreção de insulina e / ou resistência. Em 2016, o número de adultos que vivem com diabetes atingiu 422 milhões em todo o mundo e, a cada ano, 1,5 milhão de pessoas morrem desta doença, tornando-se um importante problema de saúde 1 . De fato, a diabetes descontrolada leva a vários distúrbios fisiológicos que afetam o sistema cardiovascular, os rins e os sistemas nervoso periférico e central.
Curiosamente, a hiperglicemia aguda e crônica pode alterar a cognição e contribuir com demência e depressão 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Além disso, a admissão de pacientes wA hiperglicemia tem sido associada a piores resultados funcionais, neurológicos e de sobrevivência após o AVC isquêmico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Também foi demonstrado que a hiperglicemia / diabetes afeta a neurogênese adulta, um processo que leva à geração de novos neurônios, impactando a atividade das células-tronco neurais e a diferenciação neuronal, migração e sobrevivência 2 , 12 .
Em contraste com os mamíferos, os peixes teleósticos, como o peixe-zebra, exibem uma atividade neurogênica intensa em todo o cérebro e exibem uma excelente capacidade de reparo cerebral na idade adulta 13 , 14 , 15 , 16 . Notavelmente, tais capacidades são possíveis devido à persistência de neuCélulas do caule / progenitor ral, incluindo glia radial e neuroblastos 17 , 18 , 19 . Além disso, o peixe-zebra surgiu recentemente como um modelo para estudar distúrbios metabólicos, incluindo obesidade e hiperglicemia / diabetes 20 , 21 , 22 .
Embora o peixe zebra seja um modelo bem reconhecido de hiperglicemia e neurogênese, poucos estudos investigaram o impacto da hiperglicemia na homeostase cerebral e na função cognitiva 12,23 . Para determinar o impacto da hiperglicemia na proliferação de células cerebrais induzidas por constituição e lesão, foi criado um modelo de hiperglicemia aguda através da injeção intraperitoneal de D-glucose. Além disso, um modelo de hiperglicemia crônica foi reproduzido através da imersão de peixes em água suplementada wIth D-glucose 12 . Zebrafish exibe muitas vantagens na pesquisa. Eles são baratos, fáceis de aumentar e transparentes durante os primeiros estágios de desenvolvimento, e seu genoma foi sequenciado. No contexto deste trabalho, eles também apresentam várias vantagens adicionais: (1) eles compartilham processos fisiológicos semelhantes com os seres humanos, tornando-os uma ferramenta crítica para a pesquisa biomédica; (2) permitem a rápida investigação do impacto da hiperglicemia na homeostase cerebral e neurogênese, dada a sua atividade neurogênica generalizada e forte; E (3) eles são um modelo alternativo, permitindo a redução do número de mamíferos utilizados na pesquisa. Finalmente, o peixe-zebra pode ser usado como modelo para testar a biodistribuição de moléculas radiomarcadas e potenciais agentes terapêuticos utilizando PET / CT.
O objetivo geral do procedimento a seguir é documentar visualmente como configurar modelos de hiperglicemia aguda e crônica no peixe zebra, usar zebRape para avaliar a remodelação cerebral em condições hiperglicêmicas e monitorar moléculas radiomarcadas (aqui, [ 18 F] -FDG) usando PET / CT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho descreve vários métodos para estabelecer modelos agudos e crônicos de hiperglicemia no peixe zebra. As principais vantagens desses procedimentos são as seguintes: (1) permitem uma redução no número de mamíferos utilizados para pesquisas, (2) são simples de configurar e de implementar rapidamente, e (3) são econômicas. Portanto, esses modelos permitem a investigação do impacto da hiperglicemia em um grande número de animais para estudar seu impacto em diferentes processos fisiológicos, inclui…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos muito a Direção de Uso do Numérico (DUN) da Universidade La Reunião para editar o vídeo (especialmente Jean-François Février, Eric Esnault e Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan para a narração, Mary Osborne-Pellegrin para revisão A voz-sobre e a plataforma CYROI. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Universidade La Réunion (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), do Conselho Regional da Reunião, da União Européia (CPER / FEDER) e da associação Philancia. A ACD é destinatária de uma bolsa de bolsa do Ministério da Educação Nacional, da Enseignement Supérieur e da Pesquisa, Universidade da Reunião (contrato de doutorado).
Materials
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm x 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
Referencias
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