제브라 피쉬의 고혈당의 급성 및 만성 모델 : 고혈당의 영향을 평가하는 방법 - 신경 세포 및 방사선 표지 된 분자의 생체 분포
Summary
이 연구는 제브라 피쉬에서 급성 및 만성 고혈당 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 목표는 구성 및 상해 유발 신경 발생과 같은 생리적 과정에 대한 고혈당의 영향을 조사하는 것입니다. 이 연구는 또한 PET / CT를 사용하여 방사성 동위 원소 표지 된 분자 (여기서는 [ 18 F] -FDG)를 따르는 제브라 피쉬의 사용을 강조합니다.
Abstract
고혈당은 심혈 관계 및 뇌 기능 장애로 이어지는 주요 건강 문제입니다. 예를 들어 뇌졸중 후 신경 학적 문제가 증가하고 신경 인성 과정을 손상시키는 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도, 성인 제브라 피쉬는 고혈당 / 당뇨병을 모방하고 구성 적 및 재생성 신경 발생을 조사하기위한 관련적이고 유용한 모델로 최근 등장했습니다. 이 연구는 고혈당의 제브라 피쉬 (zebrafish) 모델을 개발하여 항상성 및 뇌 수복 조건 하에서 뇌 세포 증식에 대한 고혈당의 영향을 탐구하는 방법을 제공합니다. 급성 고혈당증은 성인 제브라 피쉬에 D- 포도당 (2.5g / kg bodyweight)을 복강 내 주사하여 측정한다. 만성 고혈당증은 14 일 동안 물을 함유 한 D- 포도당 (111 mM)에 성인 제브라 피쉬를 담그면 유도됩니다. 혈당 수준 측정은 이러한 여러 접근법에 대해 설명됩니다. 구성 당뇨병에 대한 고혈당의 영향을 조사하는 방법뇌파의 기계적 손상을 기술하고, 뇌를 해부하고, 파라핀을 삽입하고, 마이크로톰으로 절편을 만들고, 면역 조직 화학 절차를 수행함으로써 재생 신경 발생을 입증합니다. 마지막으로, PET / CT를 사용하여 방사성 동위 원소 표지 된 분자 (여기서는 [ 18 F] -FDG)의 생체 분포를 연구하기위한 관련 모델로 제브라 피쉬를 사용하는 방법도 설명합니다.
Introduction
고혈당은 과도한 혈당 수준으로 정의됩니다. 급성 스트레스의 상황을 반영 할 수는 있지만, 고혈당은 또한 종종 인슐린 분비 및 / 또는 저항의 만성적 인 장애인 당뇨병의 진단으로 이어지는 상태입니다. 2016 년에 당뇨병으로 살고있는 성인의 수는 전 세계적으로 4 억 2200 만 명에 이르며 매년 150 만 명이이 질병으로 사망하여 심각한 건강 문제가됩니다 1 . 실제로 통제되지 않는 당뇨병은 심혈관 계, 신장 및 말초 및 중추 신경계에 영향을 미치는 몇 가지 생리 장애를 유발합니다.
흥미롭게도 급성 및 만성 고혈당증은 인지력을 변화시키고 치매와 우울증에 기여할 수 있습니다 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . 또한, 환자 w의 입학고혈당증은 허혈성 뇌졸중 7 , 8 , 9 , 10 , 11 후 기능적, 신경 학적 및 생존의 결과와 관련이있다. 또한 고혈당증 / 당뇨병은 신경 줄기 세포 활동과 신경 세포 분화, 이주 및 생존에 영향을줌으로써 성인 신경 발생, 새로운 신경 세포의 생성을 유도하는 과정에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다 2 , 12 .
포유류와 달리 zebrafish와 같은 원숭이 생선은 뇌 전체에 강력한 신경 인성 활동을 나타내며 성인 13 , 14 , 15 , 16 세 사이의 뇌 회복에 탁월한 능력을 나타냅니다. 주목할 만하게, 그런 수용량은 neu의 끈기 때문에 가능하다방사형 glia와 neuroblasts를 포함한 ral stem / progenitor 세포 17 , 18 , 19 . 또한, zebrafish는 최근 비만과 고혈당 / 당뇨병을 포함한 대사 장애를 연구하기위한 모델로 등장했습니다 20 , 21 , 22 .
제브라 피쉬가 고혈당증과 신경 발생의 잘 알려진 모델이지만, 고지혈증이 뇌의 항상성과인지 기능에 미치는 영향을 조사한 연구는 거의 없습니다 12 , 23 . 구성 및 상해 유도 된 뇌 세포 증식에 대한 고혈당의 영향을 결정하기 위해 D- 포도당의 복강 내 주사를 통해 급성 고혈당 모델을 만들었다. 또한 만성 고혈당 모델은 생선을 물에 담그면 재현되었다.D- 포도당 12 . Zebrafish는 연구에서 많은 이점을 보입니다. 그들은 개발의 첫 번째 단계에서 싸고 쉽게 올릴 수 있으며 투명한 상태이며 게놈은 시퀀싱되어 있습니다. 이 연구의 맥락에서, 그들은 또한 다음과 같은 몇 가지 장점을 보여준다. (1) 인간과 비슷한 생리 학적 과정을 공유하여 생물 의학 연구에 중요한 도구가된다. (2) 뇌의 항상성과 신경 발생에 미치는 고혈당의 영향을 신속하게 조사 할 수있다. (3) 그들은 대안 모델이며, 연구에 사용 된 포유류의 수를 줄일 수있다. 마지막으로 zebrafish는 PET / CT를 사용하여 방사선 표지 된 분자 및 잠재적 치료제의 생체 분포를 테스트하기위한 모델로 사용할 수 있습니다.
다음 절차의 전반적인 목표는 zebrafish에서 급성 및 만성 고혈당 모델을 설정하는 방법을 시각적으로 문서화하고 zeb고지혈증 상태에서 뇌 리모델링을 평가하고 PET / CT를 사용하여 방사성 표지 분자 (여기서는 [ 18 F] -FDG)를 모니터링합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 제브라 피쉬에서 고혈당의 급성 및 만성 모델을 수립하는 다양한 방법을 설명합니다. 이 절차의 주요 이점은 다음과 같다 : (1) 연구에 사용 된 포유류 수의 감소, (2) 설치가 쉽고 신속한 구현, (3) 경제적이다. 따라서 그러한 모델은 죽상 혈전증, 심혈 관계 기능 이상, 망막 병증, 혈액 뇌 장벽 누출, 구성 적 및 재생성 신경 발생을 비롯한 여러 생리 학적 과정에 미치는 영향을 연구하기 위…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 비디오 편집 (특히 Jean-François Février, Eric Esnault, Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan (보이스 오버), Mary Osborne-Pellegrin (교정)에 대한 La RUunion University의 Direction des Usages du Numérique (DUN) 음성 해설 및 사이로 (CYROI) 플랫폼. 이 작품은 La RUunion University (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), Conseil Régional de La Réunion, 유럽 연합 (CPER / FEDER) 및 Philancia 협회의 교부금으로 지원되었습니다. ACD는 La Réunion University (Contrat Doctoral)의 국장급 인 Supérieur et de la Recherche의 교육부 장관으로부터 교부금을 수여 받는다.
Materials
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm x 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
Referencias
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