Zebrafish में हाइपरग्लेसेमिया के तीव्र और क्रोनिक मॉडल: न्यूरोजेनेसिस पर हाइपरग्लेसेमिया के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक विधि और रेडियोलैलेबेड अणुओं के बायोडायविस्ट्रीशन
Summary
यह कार्य zebrafish में तीव्र और पुरानी हाइपरग्लेसेमिया मॉडल स्थापित करने के तरीकों का वर्णन करता है। उद्देश्य शारीरिक प्रक्रियाओं पर हाइपरग्लेसेमिया के प्रभाव की जांच करना है, जैसे कि गठन और चोट-प्रेरित न्यूरोजेनेसिस। पीईटी / सीटी का प्रयोग करके रेडियोलैबैड अणुओं (यहां, [ 18 एफ] -एफडीजी) का पालन करने के लिए काम में zebrafish का भी इस्तेमाल किया गया है।
Abstract
हाइपरग्लेसेमिया एक प्रमुख स्वास्थ्य समस्या है जो कार्डियोवास्कुलर और सेरेब्रल डिसफंक्शन को जाता है। उदाहरण के लिए, यह स्ट्रोक के बाद वृद्धि हुई न्यूरोलॉजिकल समस्याओं से जुड़ा हुआ है और न्यूरोजेनिक प्रक्रियाओं को कम करने के लिए दिखाया गया है। दिलचस्प है कि वयस्क zebrafish हाल ही में हाइपरग्लेसेमिया / मधुमेह की नकल करने के लिए एक प्रासंगिक और उपयोगी मॉडल के रूप में उभरा है और गठित और पुनर्योजी तंत्रिकाजनन की जांच करना है। यह काम होमोस्टेटिक और मस्तिष्क की मरम्मत की स्थिति के तहत मस्तिष्क कोशिका प्रसार पर हाइपरग्लेसेमिया के प्रभाव का पता लगाने के लिए हाइपरग्लेसेमिया के ज़ेब्राफी मॉडल को विकसित करने के तरीके प्रदान करता है। तीव्र हाइपरग्लेसेमिया को डी-ग्लूकोस (2.5 ग्राम / किलोग्राम वजन) के इंट्राटेरिटोनियल इंजेक्शन का इस्तेमाल वयस्क ज़ेबराफिश में किया जाता है। क्रोनिक हाइपरग्लेसेमिया 14 दिनों के लिए पानी युक्त डी-ग्लूकोस (111 मिमी) में प्रौढ़ zebrafish में डुबोकर प्रेरित है। इन विभिन्न दृष्टिकोणों के लिए रक्त ग्लूकोज-स्तर माप का वर्णन किया गया है गठित एक पर hyperglycemia के प्रभाव की जांच करने के तरीकेटेलिसेफलोन की यांत्रिक चोट का वर्णन करके, मस्तिष्क की विदारक, पैराफिन एम्बेडिंग और सूक्ष्ममाणु के साथ अनुभागिंग, और इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करके, एन डी पुनर्योजी तंत्रिकाजनन प्रदर्शित किया जाता है। अंत में, पीईटी / सीटी का प्रयोग करके रेडियोलैबैड अणुओं (यहां, [ 18 एफ] -एफडीजी) के बायोडाइस्टिशन के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल के रूप में zebrafish का प्रयोग करने का तरीका भी वर्णित है।
Introduction
हाइपरग्लेसेमिया को अत्यधिक रक्त शर्करा के स्तर के रूप में परिभाषित किया गया है। यद्यपि यह तीव्र तनाव की स्थिति को प्रतिबिंबित कर सकता है, हाइपरग्लेसेमिया भी ऐसी स्थिति है जो अक्सर मधुमेह के निदान की ओर जाता है, इंसुलिन स्राव और / या प्रतिरोध के एक गंभीर विकार। 2016 में, मधुमेह के साथ रहने वाले वयस्कों की संख्या दुनिया भर में 422 मिलियन तक पहुंच गई है, और हर साल 1.5 मिलियन लोग इस बीमारी से मर जाते हैं, जिससे यह एक प्रमुख स्वास्थ्य समस्या है 1 । दरअसल, अनियंत्रित मधुमेह कार्डियोवास्कुलर सिस्टम, गुर्दे, और परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करने वाले कई शारीरिक विकारों की ओर जाता है।
दिलचस्प बात, तीव्र और पुरानी हाइपरग्लेसेमिया अनुभूति को बदल सकती है और उन्माद और अवसाद 2 , 3 , 4 , 5 , 6 दोनों में योगदान दे सकता है। इसके अलावा, रोगियों के प्रवेश के कारणआइकेमिक स्ट्रोक 7 , 8 , 9 , 10 , 11 के बाद ith हाइपरग्लेसेमिया को बदतर कार्यात्मक, न्यूरोलॉजिकल और जीवित रहने के परिणामों के साथ जोड़ा गया है। यह भी दिखाया गया कि हाइपरग्लेसेमिया / मधुमेह वयस्क न्यूरोजेनेसिस को प्रभावित करते हैं, तंत्रिका स्टेम सेल गतिविधि और न्यूरोनल भेदभाव, प्रवासन, और अस्तित्व 2 , 12 को प्रभावित करके नए न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए एक प्रक्रिया।
स्तनधारी के विपरीत, टेलोस्ट मछली, जैसे ज़ेब्राफ़िश, संपूर्ण मस्तिष्क में तीव्र न्यूरोजेनिक गतिविधि प्रदर्शित करता है और वयस्कता 13 , 14 , 15 , 16 के दौरान मस्तिष्क की मरम्मत के लिए एक उत्कृष्ट क्षमता का प्रदर्शन करता है। विशेष रूप से, नेयू की दृढ़ता से इस तरह की क्षमता संभव हैरेडियल ग्लिया और न्यूरोबलास्ट 17 , 18 , 1 9 सहित राल स्टेम / पूर्वज कोशिकाएं। इसके अतिरिक्त, जैबैफिश हाल ही में चयापचय संबंधी विकारों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उभरा है, जिसमें मोटापा और हाइपरग्लेसेमिया / मधुमेह 20 , 21 , 22 शामिल हैं ।
हालांकि, zebrafish hyperglycemia और neurogenesis का एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त मॉडल है, कुछ अध्ययन मस्तिष्क homeostasis और संज्ञानात्मक समारोह पर hyperglycemia के प्रभाव की जांच 12 , 23 गठित और चोट प्रेरित मस्तिष्क कोशिका प्रसार पर हाइपरग्लेसेमिया के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, तीव्र हाइपरग्लेसेमिया का एक मॉडल डी-ग्लूकोज के इंट्राटेरेटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से बनाया गया था। इसके अलावा, पुरानी हाइपरग्लेसेमिया का एक मॉडल मछली के विसर्जन के माध्यम से पानी में पूरक के रूप में पुन: पेश किया गया था।Ith डी-ग्लूकोज 12 Zebrafish अनुसंधान में कई फायदे प्रदर्शित करता है। वे विकास के पहले चरण के दौरान सस्ता, उठाना आसान और पारदर्शी हैं और उनके जीनोम का अनुक्रमित किया गया है। इस काम के संदर्भ में, वे कई अतिरिक्त लाभ भी दिखाते हैं: (1) वे मनुष्यों के साथ समान शारीरिक प्रक्रियाओं को साझा करते हैं, उन्हें बायोमेडिकल अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण उपकरण बनाते हैं; (2) वे मस्तिष्क होमोस्टेसिस और न्यूरोजेनेसिस पर हाइपरग्लेसेमिया के प्रभाव की त्वरित जांच के लिए अनुमति देते हैं, जिससे उनकी व्यापक और मजबूत न्यूरोजेनिक गतिविधि होती है; और (3) वे एक वैकल्पिक मॉडल हैं, जो अनुसंधान में इस्तेमाल किए गए स्तनधारियों की संख्या में कमी की इजाजत देता है। अंत में, पीईटी / सीटी का प्रयोग करके रेडियोलैलेबेड अणुओं और संभावित चिकित्सकीय एजेंटों के बायोडायवि्रशन के परीक्षण के लिए एक मॉडल के रूप में zebrafish का उपयोग किया जा सकता है।
निम्नलिखित प्रक्रिया का समग्र लक्ष्य नेत्रहीन दस्तावेज है कि कैसे zebrafish में तीव्र और पुरानी हाइपरग्लेसेमिया के मॉडल स्थापित करने के लिए, zeb का उपयोग करेंहाइपरग्लेसेमिक स्थितियों में मस्तिष्क रीमॉडलिंग का आकलन करने के लिए राफिश, और पीईटी / सीटी का प्रयोग करके रेडियोलैबैड अणुओं (यहां, [ 18 एफ] -एफडीजी) की निगरानी करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह कार्य zebrafish में hyperglycemia के तीव्र और क्रोनिक मॉडल स्थापित करने के लिए विभिन्न तरीकों का वर्णन करता है। इन प्रक्रियाओं का मुख्य लाभ यह है कि: (1) वे अनुसंधान के लिए उपयोग किए गए स्तनधारियों की संख्या में कमी ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वीडियो को संपादित करने के लिए ला रेयूनियन यूनिवर्सिटी से (विशेष रूप से जीन-फ्रांकोइस फ़ेयरियर, एरिक इज़ानल्ट, और सिल्वेन ड्यूकेस) दिशा-निर्देशों का प्रयोग करते हैं, लियोडा-रोज़ मोटलगन, वॉयसओवर के लिए, मैरी ओसबोर्न-पेलेग्रिइन प्रूफरीडिंग के लिए आवाज-ओवर, और साइरो मंच इस काम को ला रेयूनियन यूनिवर्सिटी (बोनस क्वालिट रीशेचे, डिस्पोजिटिफेस इंकिटिफ्स), कॉन्सिल क्षेत्रीय डी ला रेयूनियन, यूरोपीय संघ (सीपीईआर / एफईडीईआर), और फिलानसिया एसोसिएशन के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था। एसीडी मिनिस्ट्रेरे डी लिक्विसेज नेशनेल, डी एल एन एसिंमेंटमेंट सुपरएयर एट डे ला रिकशे, ला रेयूनियन यूनिवर्सिटी (कॉन्ट्रेट डॉक्टोरल) से फेलोशिप अनुदान के एक प्राप्तकर्ता है।
Materials
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm x 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
Referencias
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