Summary

Akute und chronische Modelle der Hyperglykämie in Zebrafisch: Eine Methode zur Beurteilung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Neurogenese und die Biodistribution von radioaktiv markierten Molekülen

Published: June 26, 2017
doi:

Summary

Diese Arbeit beschreibt Methoden, um akute und chronische Hyperglykämie Modelle in Zebrafisch zu etablieren. Ziel ist es, die Auswirkungen von Hyperglykämie auf physiologische Prozesse, wie zB konstitutive und verletzungsinduzierte Neurogenese, zu untersuchen. Die Arbeit hebt auch die Verwendung von Zebrafisch hervor, um radiomarkierten Molekülen (hier [ 18 F] -FDG) unter Verwendung von PET / CT zu folgen.

Abstract

Hyperglykämie ist ein wichtiges gesundheitliches Problem, das zu Herz-Kreislauf-und zerebralen Dysfunktion führt. Zum Beispiel ist es mit erhöhten neurologischen Problemen nach Schlaganfall assoziiert und zeigt, dass neurogene Prozesse beeinträchtigt werden. Interessanterweise hat sich der adulte Zebrafisch vor kurzem als ein relevantes und nützliches Modell entwickelt, um Hyperglykämie / Diabetes nachzuahmen und die konstitutive und regenerative Neurogenese zu untersuchen. Diese Arbeit stellt Methoden zur Verfügung, um Zebrafisch-Modelle der Hyperglykämie zu entwickeln, um die Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Gehirnzellproliferation unter homöostatischen und Hirnreparaturbedingungen zu untersuchen. Eine akute Hyperglykämie wird unter Verwendung der intraperitonealen Injektion von D-Glucose (2,5 g / kg Körpergewicht) in erwachsenen Zebrafisch etabliert. Chronische Hyperglykämie wird durch Eintauchen von adultem Zebrafisch in D-Glucose (111 mM), das Wasser für 14 Tage enthält, induziert. Blut-Glukose-Messungen sind für diese verschiedenen Ansätze beschrieben. Methoden zur Untersuchung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf konstitutiv aNd regenerative Neurogenese, durch die Beschreibung der mechanischen Verletzung des Telencephalon, Sezierung des Gehirns, Paraffin Einbettung und Schnitt mit einem Mikrotom, und die Durchführung von Immunhistochemie Verfahren, werden nachgewiesen. Schließlich wird auch die Methode zur Verwendung von Zebrafisch als relevantem Modell zur Untersuchung der Biodistribution von radioaktiv markierten Molekülen (hier [ 18 F] -FDG) unter Verwendung von PET / CT beschrieben.

Introduction

Hyperglykämie ist definiert als übermäßige Blutzuckerwerte. Obwohl es eine Situation von akutem Stress widerspiegeln könnte, ist Hyperglykämie auch eine Bedingung, die oft zu einer Diagnose von Diabetes, einer chronischen Erkrankung der Insulinsekretion und / oder Resistenz führt. Im Jahr 2016 hat die Zahl der Erwachsenen, die mit Diabetes leben, 422 Millionen weltweit erreicht, und jedes Jahr sterben 1,5 Millionen Menschen an dieser Krankheit und sind damit ein wichtiges Gesundheitsproblem 1 . In der Tat führt unkontrollierter Diabetes zu mehreren physiologischen Störungen, die das Herz-Kreislauf-System, die Nieren und die peripheren und zentralen Nervensysteme beeinflussen.

Interessanterweise kann akute und chronische Hyperglykämie die Kognition verändern und zu Demenz und Depression beitragen 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Darüber hinaus ist die Aufnahme von Patienten mitMit Hyperglykämie wurde mit schlechteren funktionellen, neurologischen und überlebenden Ergebnissen nach ischämischem Schlaganfall 7 , 8 , 9 , 10 , 11 assoziiert. Es wurde auch gezeigt, dass Hyperglykämie / Diabetes die erwachsene Neurogenese beeinflussen, ein Prozess, der zur Entstehung neuer Neuronen führt, indem sie die neuronale Stammzellaktivität und die neuronale Differenzierung, Migration und Überleben beeinflussen 2 , 12 .

Im Gegensatz zu Säugetieren zeigen Telefische wie Zebrafisch eine intensive neurogene Aktivität im ganzen Gehirn und zeigen eine herausragende Fähigkeit zur Hirnreparatur im Erwachsenenalter 13 , 14 , 15 , 16 . Bemerkenswert ist, dass solche Kapazitäten aufgrund der Beharrlichkeit von neu möglich sindRale Stamm- / Vorläuferzellen, einschließlich radialer Glia und Neuroblasten 17 , 18 , 19 . Darüber hinaus hat sich der Zebrafisch vor kurzem als Modell für das Studium von Stoffwechselstörungen, einschließlich Fettleibigkeit und Hyperglykämie / Diabetes 20 , 21 , 22 .

Obwohl der Zebrafisch ein gut erkanntes Modell der Hyperglykämie und Neurogenese ist, haben wenige Studien die Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Hirnhomöostase und die kognitive Funktion 12 , 23 untersucht . Um die Auswirkungen von Hyperglykämie auf die konstitutive und verletzungsinduzierte Hirnzellproliferation zu bestimmen, wurde durch die intraperitoneale Injektion von D-Glucose ein Modell der akuten Hyperglykämie erzeugt. Darüber hinaus wurde ein Modell der chronischen Hyperglykämie durch das Eintauchen von Fisch in Wasser ergänzt w reproduziertMit D-Glukose 12 . Zebrafisch zeigt viele Vorteile in der Forschung. Sie sind billig, leicht zu heben und transparent während der ersten Stadien der Entwicklung, und ihr Genom wurde sequenziert. Im Rahmen dieser Arbeit zeigen sie auch mehrere zusätzliche Vorteile: (1) sie teilen ähnliche physiologische Prozesse mit Menschen und sind damit ein kritisches Instrument für die biomedizinische Forschung; (2) sie erlauben die schnelle Untersuchung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Hirnhomöostase und Neurogenese, da ihre weit verbreitete und starke neurogene Aktivität; Und (3) sie sind ein alternatives Modell, das die Verringerung der Anzahl der Säugetiere, die in der Forschung verwendet werden, ermöglicht. Schließlich kann Zebrafisch als Modell für die Prüfung der Biodistribution von radioaktiv markierten Molekülen und potentiellen therapeutischen Mitteln unter Verwendung von PET / CT verwendet werden.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, visuell zu dokumentieren, wie man Modelle der akuten und chronischen Hyperglykämie in Zebrafisch aufbaut, mit zebRafish, um die Gehirnremodellierung in hyperglykämischen Zuständen zu beurteilen und radioaktiv markierte Moleküle (hier [ 18 F] -FDG) unter Verwendung von PET / CT zu überwachen.

Protocol

Erwachsene Wildtyp Zebrafisch ( Danio rerio ) wurden unter Standard-Photoperiode (14/10 h hell / dunkel) und Temperatur (28 ° C) Bedingungen gehalten. Alle Versuche wurden im Einklang mit den französischen und europäischen Gemeinschaftsrichtlinien für die Verwendung von Tieren in der Forschung (86/609 / EWG und 2010/63 / EU) durchgeführt und wurden vom örtlichen Ethikausschuss für Tierversuche genehmigt. 1. Etablierung eines Modells der akuten Hyperglykämie in Zebrafisch <…

Representative Results

Unter Verwendung der in diesem Artikel beschriebenen Verfahren wurde die intraperitoneale Injektion von D-Glucose (2,5 g / kg Körpergewicht) auf adultem Zebrafisch durchgeführt und führte zu einer signifikanten Erhöhung der Blutzuckerwerte von 1,5 h nach der Injektion ( 1A ). 24 h nach der Injektion waren die Blutzuckerwerte zwischen D-Glucose und PBS-injizierten Fischen ähnlich. Für die chronische Behandlung wurde Zebrafisch in D-Glucose-Wasser (111 m…

Discussion

Diese Arbeit beschreibt verschiedene Methoden, um akute und chronische Modelle der Hyperglykämie in Zebrafisch zu etablieren. Die Hauptvorteile dieser Verfahren sind: (1) sie erlauben eine Verringerung der Anzahl der Säugetiere, die für die Forschung verwendet werden, (2) sie sind einfach einzurichten und schnell zu implementieren, und (3) sie sind wirtschaftlich. Daher erlauben solche Modelle die Untersuchung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf eine große Anzahl von Tieren, um ihre Auswirkungen auf verschiedene…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Direction des Usages du Numérique (DUN) von der Universität La Réunion für die Bearbeitung des Videos (insbesondere Jean-François Février, Eric Esnault und Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan für die Voiceover, Mary Osborne-Pellegrin zum Korrekturlesen Die Voice-over und die CYROI-Plattform. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der La Réunion University (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), Conseil Régional de La Réunion, Europäische Union (CPER / FEDER) und Philancia Association. ACD ist ein Empfänger eines Stipendiums Zuschuss aus der Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche, La Réunion Universität (Contrat Doctoral).

Materials

1mL Luer-Lok Syringe BD, USA 309628
4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich, Germany D8417
7 mL bijou container plain lab Dutscher, France 080171
D-glucose Sigma-Aldrich, Germany 67021
Digital camera Life Sciences, Japan Hamamatsu ORCA-ER
Disposable base molds  Simport, Canada M475-2
Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 Life Technologies, USA A21206
Embedding center Thermo Scientific, USA Shandon Histocentre 3
Fluorescence microscope Nikon, Japan Eclipse 80i
Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) Cyclotron, France
Glucometer test strip LifeScan, France One-Touch 143 Ultra
Goat anti-mouse Alexa fluor 594 Life Technologies, USA A11005
In-Vivo Imaging System TriFoil Imaging, Canada Triumph Trimodality 
Microtome Thermo Scientific, USA Microm HM 355 S
Monoclonal mouse anti-PCNA DAKO, USA clone PC10
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, Germany P6148-500G
Polyclonal rabbit anti-GFAP DAKO, USA Z033429
Slide drying bench Electrothermal, USA MH6616
Sodium chloride Sigma-Aldrich, Germany S9888
Sodium citrate trisodium salt dehydrate  Prolabo, France 27833.294
Sterile needle BD Microlance 3 30 G 1/2 ; 0.3 mm x 13 mm
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20
Student surgical scissors Fine Science Tools 91400-14
Superfros Plus Gold Slides Thermo Scientific, USA FT4981GLPLUS
Surgical microscope Leica, France M320-F12
Tissue embedding cassettes Simport, Canada M490-10
Tissue embedding medium LeicaBiosystems, USA 39602004
Toluene Sigma-Aldrich, Germany 244511
Tricaine MS-222 Sigma-Aldrich, Germany A5040
Triton X100 Sigma-Aldrich, Germany X100-500 mL
Vectashield medium  Vector Laboratories, USA H-1000
Xylene Sigma-Aldrich, Germany 534056
Fish Strain AB
Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) For preparing 10X PBS, add the following  salts and complete to 1 liter with distilled water
Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g Sigma-Aldrich, Germany 746436
Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g Sigma-Aldrich, Germany 795488
Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g  Sigma-Aldrich, Germany S9888
Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g Sigma-Aldrich, Germany 795410

Referencias

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Dorsemans, A., Lefebvre d’Hellencourt, C., Ait-Arsa, I., Jestin, E., Meilhac, O., Diotel, N. Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules. J. Vis. Exp. (124), e55203, doi:10.3791/55203 (2017).

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