Instrueret differentiering af Primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra humane pluripotente stamceller
Summary
Vi præsenterer her, humane pluripotente stamceller (hPSC) kultur protokoller, bruges til at differentiere hPSCs i CD34+ hæmatopoietisk stamfaderen. Denne metode bruger fase-specifikke manipulation af canonical WNT signalering til at angive celler udelukkende til enten det endelige eller primitive hæmatopoietisk program.
Abstract
Et af de vigtigste mål for regenerativ medicin er generation og vedligeholdelse af hæmatopoietisk stamceller (HSCs) afledt af humane pluripotente stamceller (hPSCs). Indtil for nylig, har indsatsen for at differentiere hPSCs i HSCs overvejende genereret hæmatopoietisk stamfaderen, der mangle HSC potentiale, og i stedet ligner blommesækken bloddannelsen. Disse resulterende hæmatopoietisk stamfaderen kan have begrænset nytte for in vitro- sygdom modellering af forskellige voksen hæmatopoietisk lidelser, navnlig til lymfoid lineages. Dog har vi for nylig beskrevet metoder til at generere erythro-myelo-lymfoide multilineage endelige hæmatopoietisk ophav fra hPSCs ved hjælp af en fase-specifikke styret differentiering protokol, som vi skitsere her. Gennem enzymatisk dissociation af hPSCs på basalmembranen matrix-belagt plasticware dannes embryoid organer (EBs). EBs er differentieret til mesoderm af rekombinante BMP4, som efterfølgende er fastsat til den endelige hæmatopoietisk program GSK3β-hæmmer, CHIR99021. Alternativt, primitive bloddannelsen er angivet ved PORCN-hæmmer, IWP2. Bloddannelsen drives videre gennem tilsætning af rekombinant VEGF og støttende hæmatopoietisk cytokiner. De resulterende hæmatopoietisk stamfaderen genereret ved hjælp af denne metode har potentiale til at blive brugt til sygdom og udviklingsmæssige modellering, in vitro.
Introduction
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) defineres som omfattende både humane embryonale stamceller (hESCs) og menneskeligt inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs), og har den unikke evne til ikke kun undergår selvfornyelse under passende vækstbetingelser, men også kapacitet til at differentiere sig til alle celletyper stammer fra de tre Kim lag: endoderm, mesoderm og ectoderm1. På grund af disse unikke evner holder hPSCs meget lovende for regenerativ medicin, sygdom modellering og cellebaserede behandlinger2. Mens flere celletyper har med succes blevet differentieret fra hPSCs, er en betydelig udfordring i vitro specifikationen af udelukkende voksen-lignende hPSC-afledte hæmatopoietisk stamceller (HSCs) og endelig hæmatopoietisk stamfaderen.
En sandsynlig barriere for udvikling af menneskelige HSCs fra hPSCs er tilstedeværelsen af flere hæmatopoietisk programmer inden for det menneskelige embryo3. Det første program, som opstår, betegnes “primitive bloddannelsen,” stammer senest extraembryonic blommesækken væv og kendetegnes bedst ved sin forbigående produktion af erythroblast ophav (EryP-CFC), makrofager og megakaryocytes. Navnlig dette program giver ikke anledning til HSCs, eller giver det anledning til T og B lymfoide stamceller. Dog give blommesækken forbigående anledning til begrænsede endelige hæmatopoietisk progenitorceller, såsom erythro-myeloid stamfader (EMP4,5,6,7,8) og erythroid-mangelfuld lymfoide-pulverlak Multipotente stamfader (LMPP9). Men hverken EMPs eller LMPPs er fuldt multipotente, eller i stand til af HSC-lignende engraftment i voksen modtagere. Derimod senere i udvikling, er klassisk defineret “endelige” hæmatopoietisk programmet angivet i regionen aorta-gonade-mesonephros af embryonet korrekt, giver anledning til alle voksne hæmatopoietisk lineages, herunder HSC. Specifikation af disse intra embryonale endelige hæmatopoietisk celler opstår i en hak-afhængige mode, via en endotel til hæmatopoietisk overgang fra hemogenic endotelet (han)3,10,11 ,12,13,14. Bortset fra rekonstitution kapacitet, kan multilineage potentielle og hak-afhængighed af disse celler bruges til at skelne disse endelige hæmatopoietisk ophav fra EMP og LMPP (gennemgik i referencer3,13 ).
Forståelse af de mekanismer, der regulerer primitive og endelige hæmatopoietisk specifikation fra hPSCs er sandsynligvis afgørende for reproducerbare produktion af endelige hæmatopoietisk stamfaderen på tværs af en bred vifte af hPSC linjer. Indtil for nylig, fandtes hPSC differentiering protokoller, der kunne adskille Multipotente primitive og endelige hæmatopoietisk stamfaderen ikke15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Mange tilgange ved hjælp af føtal bovint serum (FBS) og/eller stromale Co kultur først skitserede hPSC differentiering, hæmatopoietisk potentiale med blandinger af primitive og endelige hæmatopoietisk potentielle15,16, 17,19,22,23,25. Yderligere, mange serumfrit hæmatopoietisk protokoller har beskrevet signal krav til specifikationen af mesoderm fra hPSCs, at havne hæmatopoietisk potentielle18,20,21, 24. dog som disse metoder stadig gav anledning til heterogene blandinger af begge programmer, deres anvendelse i kliniske applikationer og forståelse udviklingsmæssige mekanismer kan være begrænset.
Vi har for nylig bygget på disse undersøgelser, har skitseret de fase-specifikke signal krav til ACTIVIN/NODAL og WNT signalering i primitive og endelige hæmatopoietisk specifikation fra hPSC-afledte mesoderm18,26 . Sidstnævnte var særlig enestående, da dens anvendelse af fase-specifikke WNT signal manipulation giver mulighed for specifikation af enten udelukkende primitive eller udelukkende endelige hæmatopoietisk stamfaderen26. Under mesoderm specifikation, hæmning af canonical WNT signalering med PORCN hæmmer IWP2 resulterer i specifikationen af CD43+ EryP-CFC og myeloide progenitorceller, med ingen påviselige lymfoide potentiale. I skarp kontrast, stimulering af canonical WNT signalering med GSK3β-hæmmer, CHIR99021, under den samme fase af differentiering resulterede i den fuldstændige mangel på påviselig CD43+ EryP-CFC, mens han samtidig førte til den specifikation af CD34+CD43− han. Denne populationen besad myeloid, HBG-udtrykker erythroid og T-lymfoide potentiale. Efterfølgende analyser identificeret dette var han som mangler udtryk for CD7327,28 og CD18428, og dens hæmatopoietisk potentiale NOTCH-afhængige28. Yderligere, enkelt celle klonede analyser viste, at disse endelige hæmatopoietisk lineages kunne udledes af Multipotente enkelt celler28. Taget sammen, tyder disse undersøgelser på, at fase-specifikke WNT signalering manipulation kan angive enten ren primitive hæmatopoietisk progenitorceller, eller Multipotente NOTCH-afhængige endelige hæmatopoietisk stamfaderen.
Her, skitsere vi vores differentiering strategi, der giver udelukkende primitive eller endelige hæmatopoietisk progenitorceller, via manipulation af canonical WNT signalering under mesodermale mønstre, og deres downstream hæmatopoietisk lineage assays. Denne protokol er af stor værdi for efterforskere, der er interesseret i produktion af enten primitive eller endelige hæmatopoietisk ophav fra hPSCs for regenerativ medicin programmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en hurtig, serumfrit, stroma-fri metode til differentiering af enten primitive eller endelige hæmatopoietisk stamfaderen. Mesodermale specifikation af enten primitive eller endelige hæmatopoietisk stamfaderen kan opnås pålideligt, ved hjælp af vores protokol, som entydigt udnytter lille molekyle hæmmere af canonical WNT signalering. Fase-specifikke WNT aktivering af GSK3β hæmmer CHIR9902133 giver anledning til endelige hæmatopoietisk mesoderm, hvorimod WNT hæmnin…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er blevet støttet af Department of Internal Medicine, Division af hæmatologi, Washington University School of Medicine. CD blev støttet af T32HL007088 fra National Heart, Lung, og Blood Institute. CMS blev støttet af en amerikansk samfund hæmatologi Scholar Award.
Materials
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
| TPO | R&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
| CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
| CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
| OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
| Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
| 6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
| 24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
| 6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
| 24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| 35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
| Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
| 3 cc syringes | Corning | 309657 | |
| 5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
| 5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
| 15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
| 50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
| 2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
| 5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
| 10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
| 25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
| Cell scrapers | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
| 5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
| 40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Biosafety hood | |||
| FACS AriaII or equivalent | |||
| LSRii or equivalent | |||
| FlowJo software | TreeStar | ||
| Water bath | Set at 37 C | ||
| 0.22 µM filtration system | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C refrigerator | |||
| -20 C Freezer | |||
| -80 C Freezer |
Referencias
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
- Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
- Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
- Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
- Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
- Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
- Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
- Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
- Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
- Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
- Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
- Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, (2001).
- La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
- Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
- Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Peschle, C., et al. Embryonic—-Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).
