הכנה והערכה של<sup> 99m</sup> Tc שכותרתו Tridentate chelates לחינוך קדם-מיקוד שימוש Bioorthogonal לכימיה
Summary
Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.
Abstract
Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.
Introduction
99m Tc נשאר רדיואיזוטופיים הדומיננטי בשימוש ברפואה גרעינית אבחון, עם למעלה מ -50 מיליון הליכי הדמיה שנערכו בשנת ברחבי עולם 1, 2, 3. רוב סוכני 99m Tc בשימוש קליני הם רדיואקטיביות סוג זלוף. ישנם מספר מצומצם של תרכובות ממוקדות פעיל אשר 99m Tc מופנה לאגד סמן ביולוגי ספציפי באמצעות קשירה לבנות מיקוד. יצירת רדיואקטיביות 99m Tc הממוקד מתעכבת לעתים קרובות על ידי השפעתו של 99m Tc-ליגנד מתחמים על היכולת של מולקולת המיקוד להיקשר הסמן הביולוגי של עניין, או איזוטופים מחצית החיים אינם ארוך מספיק לשימוש עם ביומולקולות משקל מולקולרי גבוה כמו נוגדנים. זה האחרון בדרך כלל דורש כמה ימים לפני תמונות נרכשות על מנת biomolecule כדי לנקות מן היעד הלא Tiss UES. מיקוד טרום מציע גישה חלופית כדי להתגבר על האתגרים אלה.
טרום מיקוד בשילוב עם כימית bioorthogonal הוכח להיות דרך יעילה לפתח בדיקות הדמיה מולקולריות חדשות לשני קרינת רדיו-הדמיה 4, 5, 6, 7, 8. הביקוש אלקטרונים הפוך- אלמון דילס (IEDDA) התגובה בין 1,2,4,5-tetrazine (טז) ו -cyclooctene טרנס (TCO) נגזרים, כפי שמוצג באיור 1, הוכח להיות יעיל במיוחד 6. התגובה IEDDA עם רכיבים אלה יכולים להפגין קינטיקה מהירה ב PBS (k 2 ≈ 6,000 M -1 s -1) סלקטיביות גבוהה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור in vivo מראש מיקוד יישומים 9, 10.
e_content "> הגישה הנפוצה ביותר בשימוש כרוך בניהול וקטור מיקוד TCO הנגזר לאחר תקופת עיכוב מספיק, tetrazine radiolabeled מנוהל. tetrazines radiolabeled מבוסס על 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 ZR, ו -111 ב כבר 11 דיווחו, 12, 13, 14, 15. לעומת זאת, יש רק אחד הדיווחים של 99m Tc שכותרתו טז, אשר הוכן באמצעות ליגנד סוג HYNIC המחייב שימוש-הליגנדים שיתוף למנוע התקשרות חלבונים והשפלה in vivo 16. כחלופה, אנו מדווחים כאן את הסינתזה של 99m Tc (I) שכותרתו tetrazines באמצעות משפחה של הליגנדים המהווים מתחמי tridentate יציבה עם [99m Tc (CO) 3] + הליבה. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pגיל = "1">
איור 1: תגובת IEDDA bioorthogonal בין tetrazine ו -cyclooctene טרנס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בני משפחתו של הליגנדים מוכן לכלול chelates tridentate שמשתנות הקוטביות ואת לאופי הקבוצה מקשר בין אזור מתכת מחייב ואת טז (איור 2). המטרה היתה לזהות 99m Tc-Tetrazine לבנות שיכול למקם ביעילות ומגיבים עם אתרים שכותרתו TCO in vivo וברור במהירות כאשר לא מחויב, על מנת להניב גבוהה היעד ל-יעד שאינו יחסי. כדי לבדוק את הליגנדים, TCO-נגזרת של ביספוספונטים (TCO-BP) שימש 17. הראינו בעבר כי TCO-BP localizes לאזורים של מטבוליזם העצם פעיל ויכול להגיב עםtetrazines radiolabeled in vivo 18. זהו מגיב נוח לבדוק tetrazines חדש, כי זה יכול להיות מוכן בשלב אחד וניסויים יכול להתבצע בעכברים נורמליים שבו לוקליזציה מתרחשת בעיקר במפרקים (ברכיים וכתפיים).
Protocol
Representative Results
Discussion
אוסף של chelates tridentate צמוד tetrazine של קטבים שונים הוכן, ואת השירות של המתחמים שלהם 99m Tc תגובת IEDDA עם נגזרת TCO in vivo הוערך. שיטת תיוג יעילה לשחזור 99m Tc פותחה במשך חמש tetrazine-chelates, שבו הריכוז ליגנד היה 10 -3 M. שלב התיוג לווה deprotection של T- קבוצות בוטיל (עבור תרכ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work supported by research grant funding from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada, the Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8), and the Canadian Cancer Society (CCS, #703857). The authors acknowledge the contributions of Dr. Denis Snider who provided assistance in preparing the manuscript.
Materials
| Argon gas | Alphagaz | — | — |
| Na2CO3 | EMD Millipore | 106395 | — |
| Na2B4O7.10H2O | Anachemia | S9640 | — |
| KNaC4H4O6.4H2O | Anachemia | 217255 | — |
| Technelite 99mTc generator | Lantheus medical imaging | — | Source of 99mTcO4- |
| 0.9% Saline | Lantheus medical imaging | — | To elute generator |
| 1 M HCl | Lab Chem | — | — |
| MeOH | Caledon | — | — |
| ACN | Caledon | — | HPLC grade |
| Millipore H2O | Thermo Fisher Scientific | Barnstead Nanopure | — |
| DCM | Caledon | — | — |
| TFA | Caledon | — | — |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 1X |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | — |
| Tween80 | Sigma Aldrich | P8047 | — |
| Isoflurane | CDMV | 108737 | Supplier: Fresenius Kabi Animal Health |
| HPLC | Waters | 1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590) | — |
| HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 | Phenomenex | 00G-4435-E0 | Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm, |
| HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 | Waters | 186003115 | XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm X 100 mm |
| Microwave Reactor | Biotage | Initiator 8 | — |
| Biotage V10 Evaporator | Biotage | Serial # V1041 | — |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25R | — |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | — |
| Animal room scale | Mettler Toledo | XP105 Delta Range | — |
| Microwave vials | Biotage | 355629 | 0.5-2 mL |
Referencias
- Jurisson, S. S., Lydon, J. D. Potential Technetium Small Molecule Radiopharmaceuticals. Chem. Rev. 99 (9), 2205-2218 (1999).
- Kluba, C. A., Mindt, T. L. Click-to-chelate: Development of Technetium and Rhenium-Tricarbonyl Labeled Radiopharmaceuticals. Molecules. 18, 3206-3226 (2013).
- Amato, I. Nuclear Medicines Conundrum. Chem. Eng. News. 87 (36), 58-70 (2009).
- Hnatowich, D. J., Virzi, F., Rusckowski, M. Investigations of Avidin and Biotin for Imaging Applications. J. Nucl. Med. 28 (8), 1294-1302 (1987).
- Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity. J. Am. Chem. Soc. 130 (41), 13518-13519 (2008).
- Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Imaging. Bioconjugate Chem. 19 (12), 2297-2299 (2008).
- Rossin, R., et al. In Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angew. Chem., Int. Ed. 49 (19), 3375-3378 (2010).
- Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Mol. Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
- Rossin, R., et al. Highly Reactive trans-Cyclooctene Tags with Improved Stability for Diels-Alder Chemistry in Living Systems. Bioconjugate Chem. 24 (7), 1210-1217 (2013).
- Rossin, R., Robillard, M. S. Pretargeted Imaging Using Bioorthogonal Chemistry in Mice. Curr. Opin. Chem. Biol. 21, 161-169 (2014).
- Denk, C., et al. Development of a 18F-Labeled Tetrazine with Favorable Pharmacokinetics for Bioorthogonal PET Imaging. Angew. Chem., Int. Ed. 53 (36), 9655-9659 (2014).
- Herth, M. M., Andersen, V. L., Lehel, S., Madsen, J., Knudsen, G. M., Kristensen, J. L. Development of a 11C-labeled Tetrazine for Rapid Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation. Chem. Commun. 49 (36), 3805-3807 (2013).
- Li, Z., et al. Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation for the Rapid Construction of 18F Labeled Probes. Chem. Commun. 46 (42), 8043 (2010).
- Nichols, B., Qin, Z., Yang, J., Vera, D. R., Devaraj, N. K. 68Ga Chelating Bioorthogonal Tetrazine Polymers for the Multistep Labeling of Cancer Biomarkers. Chem. Commun. 50 (40), 5215-5217 (2014).
- Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. J. Nucl. Med. 54 (8), 1389-1396 (2013).
- García, M. F., et al. 99mTc-Bioorthogonal Click Chemistry Reagent for In Vivo Pretargeted Imaging. Bioorg. Med. Chem. 24 (6), 1209-1215 (2016).
- Russell, R. G. G. Bisphosphonates: The First 40 Years. Bone. 49 (1), 2-19 (2011).
- Yazdani, A., et al. A Bone-Seeking Trans-Cyclooctene for Pretargeting and Bioorthogonal Chemistry: A Proof of Concept Study Using 99mTc and 177Lu-Labeled Tetrazines. J. Med. Chem. , (2016).
- Alberto, R., et al. A Novel Organometallic Aqua Complex of Technetium for the Labeling of Biomolecules: Synthesis of [99mTc(OH2)3(CO)3]+ from [99mTcO4]- in Aqueous Solution and its Reaction with a Bifunctional Ligand. J. Am. Chem. Soc. 120 (31), 7987-7988 (1998).
- Alberto, R., Ortner, K., Wheatley, N., Schibli, R., Schubiger, A. P. Synthesis and properties of boranocarbonate: A convenient in situ CO source for the aqueous preparation of [99mTc(OH2)3(CO)3. J. Am. Chem. Soc. 123 (13), 3135-3136 (2001).
- Lu, G., et al. Synthesis and SAR of 99mTc/Re-labeled Small Molecule Prostate Specific Membrane Antigen Inhibitors with Novel Polar Chelates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1557-1563 (2013).
- Maresca, K. P., et al. Small Molecule Inhibitors of PSMA Incorporating Technetium-99m for Imaging Prostate Cancer: Effects of Chelate Design on Pharmacokinetics. Inorg. Chim. Acta. 389, 168-175 (2012).
- Bartholomä, M. D., et al. Insight into the Mode of Action of Re(CO)3 Thymidine Complexes. ChemMedChem. 5 (9), 1513-1529 (2010).
