Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.
Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.
99m Tc bleibt die dominierende Radioisotop in der diagnostischen Nuklearmedizin verwendet wird , mit mehr als 50 Millionen Bildgebungsverfahren pro Jahr weltweit durchgeführt 1, 2, 3. Die Mehrheit der 99m Tc Mittel werden klinisch Perfusion Radiopharmaka. Es gibt eine begrenzte Anzahl von aktiv gezielte Verbindungen , in denen 99m Tc gerichtet ist eine spezifische Biomarker durch Ligation an ein Targeting – Konstrukt zu binden. Die Erzeugung gezielter 99m Tc – Radiopharmaka wird häufig durch den Einfluß von 99m Tc-Ligand – Komplexe auf die Fähigkeit des dirigierenden Moleküls zu binden , um die Biomarker von Interesse gehinderte oder die Isotopen – Halbwertszeit nicht lang genug ist für die Verwendung mit höherem Molekulargewicht Biomoleküle wie Antikörper. Letzteres erfordert üblicherweise mehrere Tage vor Bildern, um für das Biomolekül erworben werden von Nicht-Ziel zu löschen tiss ues. Pre-Targeting bietet einen alternativen Ansatz, diese Herausforderungen zu überwinden.
Pre-Targeting mit bioorthogonale Chemie kombiniert wurde ein effektiver Weg gezeigt werden , für die Entwicklung neuer molekularer Bildgebungssonden sowohl für Fluoreszenz und Radio-Imaging – 4, 5, 6, 7, 8. Die inversem Elektronenbedarf Diels-Alder (IEDDA) Reaktion zwischen 1,2,4,5-Tetrazin (Tz) und trans -Cycloocten (TCO) -Derivate, wie in Figur 1 gezeigt ist , hat sich als besonders wirksam 6 erwiesen. Die IEDDA Reaktion mit diesen Komponenten können schnell Kinetik in PBS (k 2 ≈ 6000 M -1 s -1) und eine hohe Selektivität aufweisen, wodurch es ideal für de – vivo – Pre-Targeting – Anwendungen macht 9, 10.
e_content "> Die am häufigsten verwendete Ansatz umfasst ein TCO-derived Targeting – Vektor Verwaltung und eine ausreichende Verzögerung Folgezeit ein radioaktiv markiertes Tetrazin verabreicht. Radiolabeled Tetrazinen basierend auf 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr und 111 In gewesen 11 berichtete, 12, 13, 14, 15. im Gegensatz dazu gibt es nur einen Bericht eines 99m ist Tz-Tc markiert, die eine HYNIC – Typ – Liganden wurde unter Verwendung von der Verwendung von Co-Liganden erfordern Protein zu verhindern Bindung und den Abbau in vivo 16. Alternativ berichten wir hier die Synthese von 99m Tc (I) markiertem Tetrazinen eine Familie von Liganden , die mit einem [99m Tc (CO) 3] + Kern stabil dreizähnige Komplexe bilden. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1">Die Familie von Liganden hergestellt enthalten dreizähnigen Chelate , die in der Polarität und der Natur der Linkergruppe zwischen der Metallbindungsbereich und dem Tz (Abbildung 2) variieren. Das Ziel war es, ein 99m zu identifizieren Tc-Tetrazin , dass effektiv lokalisieren und reagieren mit TCO-markierten Stellen in vivo konstruieren konnte und schnell klar , wenn sie nicht gebunden, um eine hohe Ziel-zu-Nichtziel – Verhältnisse zu erhalten. Um die Liganden zu testen, ein TCO-Derivat einer Bisphosphonat (TCO-BP) wurde 17 verwendet. Wir haben bereits gezeigt, dass TCO-BP zu den Bereichen der aktiven Knochenmetabolismus lokalisiert und reagieren mitradiomarkierten Tetrazinen in vivo 18. Es ist eine bequeme Reagenz neue Tetrazinen zu testen, da es in einem einzigen Schritt hergestellt werden können, und Experimente können in normalen Mäusen durchgeführt werden, in denen die Lokalisierung in erster Linie in den Gelenken (Knie und Schultern) auftritt.
Eine Sammlung von Tetrazin-linked dreizähnigen Chelate verschiedener Polaritäten wurde hergestellt, und die Nützlichkeit der 99m Tc – Komplexe in der IEDDA Reaktion mit einer TCO – Derivat in vivo bewertet. Eine effektive und reproduzierbare 99m Tc wurde Markierungsverfahren für fünf Tetrazin-Chelate entwickelt, wobei der Ligand – Konzentration 10 -3 M. war der Markierungsschritt durch Entfernung der Schutzgruppe von t- Butyl – Gruppen (für die Verbindungen <stron…
The authors have nothing to disclose.
This work supported by research grant funding from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada, the Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8), and the Canadian Cancer Society (CCS, #703857). The authors acknowledge the contributions of Dr. Denis Snider who provided assistance in preparing the manuscript.
Argon gas | Alphagaz | — | — |
Na2CO3 | EMD Millipore | 106395 | — |
Na2B4O7.10H2O | Anachemia | S9640 | — |
KNaC4H4O6.4H2O | Anachemia | 217255 | — |
Technelite 99mTc generator | Lantheus medical imaging | — | Source of 99mTcO4- |
0.9% Saline | Lantheus medical imaging | — | To elute generator |
1 M HCl | Lab Chem | — | — |
MeOH | Caledon | — | — |
ACN | Caledon | — | HPLC grade |
Millipore H2O | Thermo Fisher Scientific | Barnstead Nanopure | — |
DCM | Caledon | — | — |
TFA | Caledon | — | — |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 1X |
BSA | Sigma Aldrich | A7906 | — |
Tween80 | Sigma Aldrich | P8047 | — |
Isoflurane | CDMV | 108737 | Supplier: Fresenius Kabi Animal Health |
HPLC | Waters | 1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590) | — |
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 | Phenomenex | 00G-4435-E0 | Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm, |
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 | Waters | 186003115 | XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm X 100 mm |
Microwave Reactor | Biotage | Initiator 8 | — |
Biotage V10 Evaporator | Biotage | Serial # V1041 | — |
Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25R | — |
Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | — |
Animal room scale | Mettler Toledo | XP105 Delta Range | — |
Microwave vials | Biotage | 355629 | 0.5-2 mL |