<em> 전의 VIVO</em> 방법 배양 된 쥐 장간막 미세 혈관 네트워크의 타임 랩스 영상에 대한
Summary
Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.
Abstract
혈관 신생은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장과 같이 정의, 내피 세포, 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 면역 세포 및 림프관 및 신경과 조정을 포함한다. 멀티 셀, 멀티 시스템의 상호 작용은 생리 학적으로 관련 환경에서 혈관 신생의 조사를 필요로한다. 시험관 내 세포 배양 모델의 사용은 기계적인 통계를 제공 한 상태 즉, 일반적인 비판은 미세 혈관 네트워크와 연관된 복잡성 요점을 되풀이하지 않는다는 것이다. 이 프로토콜의 목적은 전 배양 된 쥐 장간막 조직에서 혈관 신생을 자극 한 후 그대로 미세 혈관 망의 경과 비교를 할 수있는 능력을 입증하는 것이다. 배양 된 조직은 계층 구조를 유지하는 미세 혈관 네트워크를 포함한다. 면역 표지 내피 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 혈관과 림프관의 존재를 확인한다. 안에ddition는 BSI-렉틴과 조직을 라벨은 이전과 증가 된 모세 혈관의 발아 및 혈관 밀도를 특징으로 혈청 성장 인자의 자극 후 로컬 네트워크 영역의 시간 경과 비교를 할 수 있습니다. 일반적인 세포 배양 모델에 비해,이 방법은 생리 학적으로 관련 미세 혈관 내피 세포 네트워크의 계통 연구 및 조직 특이 적 혈관 형성 약물 평가하는 툴을 제공한다.
Introduction
미세 혈관 망의 성장 및 리모델링 조직 기능의 공통 분모, 상처 치유, 및 여러 병리이며 주요 공정은 기존의 1, 2에서 새로운 혈관의 성장으로 정의 혈관이다. 새로운 혈관을 엔지니어링 또는 혈관 신생에 관여하는 세포 역학의 중요성을 이해 혈관 기초 요법을 설계 조직 중요하다. 그러나이 프로세스는 복잡하다. 이것은 미세 혈관 망의 특정 위치에서 변화 여러 종류의 세포 (즉, 내피 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 대식 세포, 줄기 세포) 및 여러 시스템 (림프 네트워크, 신경 네트워크)을 포함 할 수있다. 시험관 내 혈관 신생 모델 (3)에 관련된 다른 셀들 간의 관계를 검사에 엄청난 공헌하지만, 생리 학적 관련성 파묻혀 인해 훼손 될 수있다 제한된 복잡하고 밀접 생체 시나리오를 반영하지 않는다는 사실을 r에. 이러한 한계의 3 차원 배양 시스템을 극복하기 위해 3, 생체 조직의 모델 (4), 마이크로 유체 시스템의 5, 6, 최근 개발되어 소개되었다 7 계산 모델. 그러나, 미세 혈관 손상 네트워크 생체의 혈관 신생을 조사하는 저속 기능이 모델에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 복잡성의 수준과 혈관 신생 연구를위한 새로운 시간 경과 모델의 설립은 혈관 신생을 조절하는 기본 메커니즘을 이해하는 귀중한 도구를 제공하고 치료법을 개선 할 수 있습니다.
손상되지 않은 미세 혈관 네트워크를 통해 혈관 신생의 생체 조사를 가능하게하는 잠재적 인 모델은 쥐 장간막 문화 모델> 8. 최근 연구에서, 우리는 혈액과 림프 미세 혈관 네트워크는 문화 후 가능한 남아 있음을 증명하고있다. 더 중요한 것은, 래트 장간막 배양 모델은 기능적 주연 세포 – 내피 세포 상호 작용, 혈액 및 림프관 내피 세포 연결, 저속 촬상을 조사하는데 사용될 수있다. 본 연구의 목적은 시간 경과 영상 법을위한 우리의 프로토콜을 제공하는 것이다. 우리의 대표적인 결과는 혈청과 혈관의 자극 후 생존을 유지하고 조직 특이 적 혈관 반응뿐만 아니라 내피 세포 추적 연구를 정량화이 방법을 사용 예제를 제공하는 여러 세포 유형을 문서화합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 미세 혈관 망 성장 저속 촬상 용 생체 도구 래트 장간막 배양 모델을 사용하는 방법을 설명합니다. 우리 실험실에서 이전 작업은 1 우리의 모델) 혈관 신생 (8), 2) 림프관 8, 3) 주연 세포 – 내피 세포 상호 작용 8, 4) 항 혈관 약물 검사 (9)의 사용을 설립했다. 여러 시점에서 배양 된 쥐 장간막 조직을 이미징 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.
Materials
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12”x12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4"x4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5ml | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/ml |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/ml |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
Referencias
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
- Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).
- Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
- Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
- Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
- Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
- Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
- Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
- Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
- Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
- Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).
