Isolement de souris endométriale épithéliales et stromales Cellules pour<em> In vitro</em> decidualization

AlexaFluor Toutes les expériences sur les animaux pour cette étude ont été approuvés par le comité d'éthique de la KU Leuven (Belgique) (Projet P174 / 2013). Les souris ont été logées dans des conditions standard, avec un accès ad libitum à des boulettes de nourriture et de l' eau du robinet, et maintenus dans des conditions contrôlées (23 ± 1,5 ° C, humidité relative 40 – 60%, 12/12 cycle lumière / obscurité). 1. Souris Utilisez souche de souris disponible dans le commerce ( par exemple C57BL / 6, femelle 8 – 12 semaines). En règle générale, 4 – 5 souris donneront une quantité appropriée de cellules pour d'autres expériences. Injecter souris intactes sous-cutanée avec 100 ul de la 17β-estradiol (E2) solution (100 ng / 100 pi) pour 3 années consécutives d avant l'isolement afin de normaliser la phase du cycle oestral des animaux et à induire la prolifération de l'endomètre cellules. La nécessité de vérifier la phase du cycle des souris avant de démarrer le protocole est évitablescause de la 3 d 'un traitement de l'estradiol. 2. Préparatifs Faire une solution de 100 ng / 100 pi E2 dans l'huile d'arachide. Pour les injections de cinq souris (comme décrit en 1.2), une quantité de 1,5 ml est nécessaire. Dissoudre 1 mg E2 dans 1 ml d'éthanol à une solution mère de 1 mg / mL. Diluer cette solution de stock 1: 1000 dans l'huile d'arachide. Faire 500 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBBS) 1x complété avec 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine (ci-après dénommé HBSS +). Faire 500 mL de filtre cellulaire Souris endométriale stromales (MESC) moyen à la culture MESC: Modified Eagle Medium / mélange nutritif F12 de Dulbecco (DMEM / F12) avec du phénol rouge, L-glutamine et de 4- (2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-éthanesulfonique l' acide N – (2-hydroxyéthyl) pipérazine N '- (2-éthanesulfonique) (HEPES) contenant 10% de FBS, 0,5 pg / ml d' amphotéricine B et 100 pg / ml de gentamicine (fucomplémen appelé moyen MESC). Faire 500 ml de milieu filtré MESC 2% à la culture pendant MESC decidualization: DMEM / F12 avec du rouge de phénol, L-glutamine et HEPES contenant 2% de FBS, 0,5 pg / ml d'amphotéricine B et 100 pg / ml de gentamicine. Préparer 500 ml de filtration de cellules de souris endométriale épithéliale (MEEC) milieu: DMEM contenant 10% de FBS, 0,5 pg / ml d'amphotéricine B, 100 pg / ml de gentamicine, 25% MCDB-105 moyennes et 5 pg / ml d'insuline (appelés ci-après comme milieu MEEC). Préparer des lamelles Poly-L-lysine (PLL) revêtus pour la culture MESC. Dissoudre 25 mg de PLL dans 250 ml d'eau distillée. Filtrer la solution en utilisant un filtre de 0,22 um. Ajouter des lamelles stériles dans une plaque de 12 puits. Ajouter 300 pi de PLL dissous sur les lamelles. On élimine la solution au bout de 30 min d'incubation. Les plaques peuvent être conservées à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure (jusqu'à 1 – 2 mois). Préparer un 10 mg / ml solution mère of collagénase de type IA et de stocker des aliquotes de 300 pi à -20 ° C. Filtrer avant utilisation. 3. Préparatifs obligatoires 24 h avant Isolation Préparer collagène des lamelles enrobées pour la culture MEEC. Préparer une solution d'acide acétique 0,02 M dans de l'eau distillée (1 ml par lamelle couvre-objet). Ajouter 150 ul de collagène dans 12 ml de 0,02 M d'acide acétique pour obtenir une concentration finale de 50 pg / ml. Ajouter des lamelles stériles dans une plaque de 12 puits. Ajouter 1 ml de la solution de collagène (voir 3.1.2). Incuber O / N (minimum 12 h) à 37 ° C. Au cours de l' isolement: Retirer la solution de collagène au large des lamelles par aspiration et le laisser sécher à l'air dans un environnement stérile (dans la hotte à flux laminaire). On lave les lamelles couvre-objet à deux reprises avec un tampon phosphate salin (PBS). Préparer une solution de pancréatine à 2,5% par addition de 0,25 g de pancreatine dans un tube canonique 15 ml contenant 10 ml deHBSS +. Agiter (200 tours par minute), la solution à 37 ° C pendant 1 h pour augmenter la solubilité. Conserver à 4 ° C. 4. Isolement et culture de cellules de souris endométriale épithéliales (MEEC) et souris endométriale stromales Cellules (MESC) Ajouter 25 mg de trypsine dans un tube de 15 ml contenant une solution de pancréatine de 2,5% (voir 3.2) pour finir avec une solution finale contenant 0,25% de trypsine (ci-après dénommé MESC digestion mix). L' isolement de l' utérus Vérifiez la phase du cycle des animaux avec un examen de frottis vaginal. Restreindre l'animal et rincer le vagin doucement avec 50 ul de PBS 3 – 5 fois. Recueillir le rinçage final sur une lame de verre. Examiner le matériau sous un microscope à champ clair en utilisant un objectif 10X ou 20X. Utilisez uniquement des souris qui sont dans la phase oestrus. Cette étape se caractérise par la présence de cellules epitheliales cornifiées dans le lavage vaginal (figure 1 </strong>). Euthanasier les animaux à l' aide d' une méthode appropriée telle que la dislocation cervicale ou CO 2 narcose induite. Pulvériser les carcasses avec 70% d'éthanol afin de générer un environnement stérile. L'utilisation d'outils chirurgicaux stériles, ouvrir l'abdomen et pousser les intestins de côté pour visualiser les deux cornes utérines. Prenez la corne de l'utérus à l'extrémité la plus distale dans la trompe de Fallope. Disséquer les cornes utérines de la trompe de Fallope et enlever les tissus adipeux et conjonctif. Découpez la corne à l'extrémité distale au-dessus du corps de l'utérus et le placer dans un plat de 35 mm de Pétri avec 3 ml de HBSS +. Répétez cette étape pour l'autre corne et pour les autres animaux jusqu'à ce que toutes les cornes utérines sont recueillies. Nettoyer la corne utérine (en HBSS +) plus loin sous un stéréoscope et enlever toute adipeuse résiduelle ou de tissu conjonctif. Couper les cornes utérines ouvertes longitudinalement pour exposer la lumière utérine et remplacer ecorne e dans une nouvelle boîte de Pétri avec HBSS frais +. Transférez toutes les cornes utérines au tube 15 ml contenant de la pancréatine et de la trypsine. Incuber horizontalement pendant 60 min à 4 ° C sur un agitateur orbital (50 rpm). Incuber horizontalement pendant 45 min à 23 ° C (RT), sans agitation. Incuber horizontalement pendant 15 min à 37 ° C (bain d'eau), sans agitation. Pendant ce temps la digestion mélange MESC en dissolvant 300 pi de 1 mg / ml de collagénase actions dans 2,7 ml de 0,05% d'acide trypsine-Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) solution. REMARQUE: A partir de maintenant, d'autres étapes d'isolement sont réalisées dans un environnement stérile sous une hotte à flux laminaire. Souris endométriale cellules épithéliales (MEEC) Culture Après 2 heures d'incubation, soigneusement videz la solution de surnageant. Transfert du col dans une boîte de Pétri contenant du milieu MEEC froid et incuber pendant 5 min pour inactiver la trypsineactivité. Transférer le col d'un tube de 15 ml contenant 3 ml de HBSS froid +. Vortex pendant 10 s pour libérer les feuilles épithéliales. Rincer le col dans un plat propre Petri avec 3 ml HBSS +. Répétez l'étape 4.3.2 – 4.3.4 pour obtenir un total de trois suspensions contenant des feuilles épithéliales. Transfert du col à la digestion mix MESC et incuber pendant 30 min à 37 ° C tout en agitant (200 tours par minute) (passez à l'étape 4.4 pour davantage d'isolement de MESC). Récupérer les feuilles epitheliales en pipettant trois suspensions cellulaires doucement sur une maille de nylon de 100 um afin d'éliminer les débris de tissu. Centrifuger la suspension cellulaire recueillie à 500 xg pendant 5 min. Reprendre le culot dans 12 ml de milieu MEEC et bien mélanger. Installez la solution pendant 5 minutes afin de séparer en restant MESC utilisant la gravité de la sédimentation. Retirez soigneusement les 2 ml supérieures à l'aide d'une pipette de 5 ml. Centrifuger le suspensio cellulairen à 500 xg pendant 5 min. Resuspendre en milieu MEEC par pipetage de haut en bas. Plaquer les cellules sur des lamelles revêtues de collagène dans la densité souhaitée pour d' autres expériences (Figure 2a). Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant au moins 12 heures. NOTE: Pour immunocoloration ou des expériences fonctionnelles comme l'imagerie calcique fluorescente, il est conseillé de plaquer les cellules directement sur les lamelles, tandis que l'ensemencement dans une plaque de 6 puits est recommandée lorsque l'ARN ou d'une protéine isolée est souhaitée. L'isolement des cellules stromales endométriales de souris est divisé en deux tours que la pureté des cellules après seulement une digestion peut être insuffisante. Les utérus sont digérés deux fois pour une récupération optimale des cellules et de la pureté. Dans les deux tours les interventions techniques sont identiques. Les cellules recueillies à partir des deux tours peuvent être conservés pour d'autres expériences, comme souhaité par le chercheur. Souris endométriale StrCellule omal (MESC) Culture: 1er tour Avant le début de la première ronde de la digestion, préparer un second mélange de digestion en dissolvant 300 pi de 1 mg / ml de collagénase actions dans 2,7 ml solution à 0,05% de trypsine-EDTA. Ce mélange est nécessaire à l'étape 4.4.8. Préparer trois petites boîtes de Pétri de froid (4 ° C) HBSS + et 3 x 15 tubes ml avec 3 ml de milieu MESC (tube de X1, X2 et X3). Après 30 min d'incubation, agiter la solution de trypsine contenant de l'utérus-doucement pendant 10 s. MESC cellules se détacher du tissu utérin et restent dans la solution de trypsine. Transférez le col de la première boîte de Pétri contenant 3 mL froid (4 ° C) HBSS + et bien rincer. Ajouter 3 ml de milieu MESC dans le tube contenant l'origine des cornes utérines (tube dans l'étape 4.4.3) pour inhiber l'activité de la trypsine. Transférez le col de la boîte de Pétri avec le froid (4 ° C) HBSS + X1 tube contenant 3 ml de milieu MESC et agiter doucement pendant 10 s. </li> Répétez les étapes 4.4.4 (transfert à une boîte de Pétri de froid (4 ° C) HBSS +) et 4.4.6 (transfert à X2 tube et X3) deux fois. REMARQUE: Enfin, ce protocole se traduira par 4 suspensions cellulaires: un tube contenant la solution de trypsine et de 3 tubes avec un milieu contenant MESC MESC (tubes X1, X2 et X3). Transférer dans l'utérus de la nouvelle digestion MESC, tel que décrit dans l'étape 4.4.1 et incuber pendant 30 min à 37 ° C, à la verticale. Recueillir les cellules stromales en faisant passer les quatre suspensions de cellules à travers une maille de nylon de 40 pm. Rincer la maille avec une 5 ml supplémentaires de MESC. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 g pendant 7 min. Reprendre le culot dans MESC et la plaque sur des lamelles PLL revêtues pour d'autres expériences avec la densité désirée. Laisser incuber pendant au moins 4 – 6 h ou O / N à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Souris endométriale cellules stromales (MESC) Culture: 2 e ronde <ol> Préparer trois petites boîtes de Pétri de froid (4 ° C) HBSS + et 3 x 15 tubes ml avec 3 ml de milieu MESC (Tubes Y1, Y2 et Y3). Répétez les étapes 4.4.3 – 4.4.7. Transférer la dernière suspension de cellules avec le col à une maille de nylon de 40 pm. Recueillir les cellules stromales en faisant passer le contenu du tube de Y1, Y2 et Y3 à travers les mailles de nylon. Rincer la maille avec une 5 ml supplémentaires de MESC. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 g pendant 7 min. Remettre en suspension le culot dans du milieu MESC et de la plaque sur des lamelles revêtues PLL pour d' autres expériences (Figure 2b). Laisser incuber pendant au moins 4-6 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2. NOTE: Pour immunocoloration ou des expériences fonctionnelles comme l'imagerie calcique fluorescente, il est conseillé de plaquer les cellules sur des lamelles, tandis que l'ensemencement dans une plaque de 6 puits est recommandée lorsque l'ARN ou d'une protéine isolée est souhaitée. 5. vimentine/ Cytokeratin Double Coloration pour la validation de MEEC pure et Cultures MESC Ensemencer les cellules sur des lamelles. Laver 3 x 5 min avec du PBS contenant du calcium et du magnésium sur un agitateur orbital (50 rpm). Fixer les cellules avec 4% de paraformaldehyde (PFA) (ATTENTION!) Pendant 10 min, pas sur un agitateur. Laver 3x avec PBS sans calcium et de magnésium sur un agitateur (50 rpm). Perméabiliser les cellules avec 0,2% de Triton X-100 pendant 10 min sur une secoueuse (50 tpm). Laver 3x avec PBS sur un agitateur. Bloc avec du sérum à 5% de chèvre (GS) dans du PBS pendant 2 heures sur un agitateur (50 tours par minute) Incuber les cellules avec un anticorps monoclonal de lapin anti-humain de la vimentine (1: 500) et pancytokeratin anticorps monoclonal de souris anti-humain (1: 1000) à 4 ° C sur un agitateur (50 tpm). Les anticorps sont dilués dans du PBS avec 0,5% de GS. Laver 3x avec PBS sur un agitateur (50 rpm). Incuber les cellules avec des anticorps secondaires (1: 1000 dans 0,5% GS) Alexa Fluor 488 conjugué IgG anti-lapin Alexa Fluor 488 et Conju-IgG anti-souris fermée sur un agitateur. Laver 3x avec PBS sur un agitateur. Mont glisse avec milieu de montage aqueux contenant DAPI et O sec / N. Sceller les lames avec le vernis à ongles et continuer à 4 ° C pour une utilisation ultérieure (Figure 2a, b). 6. In Vitro decidualization dans un système coculture NOTE: Quatre à cinq animaux sont nécessaires pour établir un système de coculture dans une plaque de 24 puits. Poursuivre le protocole suivant dans un environnement stérile, de préférence sous une hotte à flux laminaire. Préparer des inserts de culture cellulaire lors de la centrifugation et / ou les étapes d'incubation de l'isolement des cellules epitheliales (comme décrit en 4.3) dans une plaque de 24 puits supplémentaire. Ajouter 200 – 400 ul de milieu MESC dans la quantité souhaitée de puits dans la plaque à 24 puits. Placer les inserts dans les préremplies 24 puits à l'aide de pinces stériles. Reprendre le culot MEEC(Volume de travail: 150 – 300 uL par insert) (étape 4.3.14) dans un milieu MEEC et diviser sur les inserts. La culture des cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Ensemencer les cellules stromales dans une autre plaque de 24 puits (compatibles avec les inserts de culture cellulaire) après le second tour de l'isolement de cellules stromales (étape 4.5.6). Utiliser un volume de travail de 400 ul de suspension cellulaire par puits. Laisser les cellules stromales se fixer pendant au moins 4-6 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Transférer les inserts de culture cellulaire recouvertes de cellules épithéliales à partir de la première plaque de 24 puits dans la deuxième plaque à 24 puits recouverte par les cellules stromales. Utilisez des pinces stérilisées ou toucher les inserts seulement à leur pied suspendu. La culture des cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant une période de 3 à 5 d jusqu'à ce que les cellules épithéliales forment une monocouche et les cellules stromales atteignent 80-90% de confluence. En outre, utiliser la résistance électrique transépithélial (TEER)pour surveiller la monocouche epitheliale par l' utilisation d'un appareil de mesure épithéliale volts / ohms comme décrit par Grant et al. 7. Les valeurs de 800-1000 / puits étaient suffisantes pour tenir compte de la monocouche confluentes épithéliale. Si nécessaire, remplacer le milieu tous les 2 – 3 d en utilisant des pipettes de verre ou les embouts de pipettes fines. Commencer avec le remplacement du milieu des cellules stromales (semés en bas), avant de remplacer le milieu dans des inserts. Il est recommandé d'utiliser préchauffé milieu de culture cellulaire à 37 ° C. Préparer le milieu de decidualization pour induire en decidualization vitro avant de commencer l'expérience. Utiliser un volume de travail de 400 ul par puits de cellules stromales. Préparer les solutions mères suivantes et aliquotes stocker à -20 ° C. Préparer 250 uM médroxyprogestérone 17-acétate (MPA) dans l'éthanol. Préparer mM solution 100 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-AMPc dans l'eau ultrapure. Faire le moyen decidual contenant 1 uM MPA et mM AMPc 0,5 dans un milieu de MESC contenant 2% de FBS. Retirez délicatement le milieu des puits et ajouter le support decidual sur les cellules stromales. Si une condition de contrôle est nécessaire, utiliser le milieu MESC contenant 2% de FBS. Éliminer le milieu à partir des inserts de culture de cellules et ajouter 300 ul de milieu MEEC sur les cellules. Incuber les cellules pendant 5 jours dans un incubateur à 37 ° C dans 5% de CO2. Après le cinquième jour, évaluer l'étendue des decidualization dans les cellules stromales par RT-qPCR (voir ci-dessous). Valider la viabilité des cellules épithéliales en utilisant le réactif à base de viabilité résazurine. Préparer une solution 1:10 de réactif de viabilité en milieu MEEC. Transférer les inserts de culture cellulaire dans une nouvelle plaque de 24 puits. Ajouter 150 – 300 ul du réactif de viabilité – solution MEEC sur les cellules. Incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant aumoins 4-5 h ou toute la nuit et évaluer la viabilité des cellules en observant un changement de couleur (bleu au violet / rose). NOTE: decidualization peut également être évaluée en utilisant un test ELISA souris prolactine spécifique, comme préféré par le chercheur. 7.Validation de decidualization par qRT-PCR NOTE: Pour la validation de la decidualization par qRT-PCR, il est recommandé d'effectuer tous les tests-conditions en double afin de recevoir une quantité suffisante de cellules pour l'analyse de l'ARN. RT-PCR quantitative est réalisée comme précédemment décrit dans De Clercq et al. 8. En bref: Isoler l'ARN total en utilisant un kit d'isolement d'ARN commercial. Évaluer la quantité et la qualité de l'ARN en utilisant des méthodes commerciales selon le protocole du fabricant, respectivement. La synthèse d'ADNc, selon le protocole du fabricant à partir de 1 ug d'ARN total. Utiliser un kit commercial en suivant le protocole du fabricant pour effectuer la réaction qRT-PCR. Exécutez tous les échantillons en triple exemplaire. Faire usage de la publicité TaqMan Master Mix et des sondes TaqMan spécifiques pour les gènes de ménage souhaités et prolactine (prl8a2) pour mener à bien la réaction.