通过DNA含量测定的哺乳动物复制时序的全基因组的测定
Summary
We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.
Abstract
基因组的复制过程中在一个高度调节的过程，以确保DNA复制的保真度在细胞周期的S期时发生。每个基因组区域是在不同的时间在S期通过复制多个起源的同时激活复制。复制（TOR）的时间与许多基因组和表观遗传特征相关，并链接到突变率和癌症。解读复制程序的完整基因组认为，在健康和疾病是未来的一个主要目标和挑战。
本文详细介绍了该法的“S / G1的用于映射复制基因组时代拷贝数比率”（以下称为：CNR-TOR），一个简单的方法来绘制哺乳动物细胞的基因组范围的职责范围。该方法是基于S期细胞和G1期细胞的拷贝数的差异。在6个步骤进行CNR-TOR方法：1，细胞和染色与碘化丙啶（PI）的制备; 2.索尔廷G1和使用荧光激活细胞分选S期细胞（FACS）; 3. DNA纯化; 4.超声; 5.文库制备和测序; （六）生物信息学分析。该CNR-TOR法是一种快速简便的办法，导致了详细的复制地图。
Introduction
哺乳动物DNA复制是严格调节细胞周期过程中，以确保精确地一次每个染色体的精确复制。复制根据一个高度管制的次序发生-多个大型基因组区域（〜兆）S期的开始复制（早期复制域），而其他的基因组区域的中后期S期（中晚期复制域）后重复1。大多数基因组的复制在所有组织中（组成职责范围域）的同时，而30％ -在基因组的50％，也期间癌症转化5改变组织2之间它的职责范围，分化3,4期间和在较小程度上。此外，某些基因组区域复制异步6，7，8，即是有区别的在两个等位基因之间的职责范围。
职责范围与许多基因组和表观基因的功能，包括转录水平，GC含量，染色质的状态，基因密度等 1,9相关。职责范围也与突变率和类型10，11，因此毫不奇怪相关联，则复制程序的扰动与癌症12,13。职责范围和染色质结构之间的因果关系尚不清楚。这可能是开放的染色质促进早期复制。然而，另一种模型表明，在复制过程中的染色质组装和存在于开头的不同染色质调节和S期引线端至差分早期和晚期复制区域1的包装，14 </sup>。我们最近表明，职责范围形状通过影响发生在不同的基因组区域11突变型GC含量。
荧光原位杂交（FISH）是在各个基因检测职责范围的主要方法。它是通过计算显示出单一的FISH信号与双重对于给定的等位基因15,16百分比S期细胞的百分比简单地进行。一种替代方法，由脉冲的标记用BrdU的DNA，根据它们的DNA含量，以多个时间点沿小号分拣细胞，免疫沉淀含有BrdU的DNA，并检查沉淀的DNA的丰度与定量PCR 17。
基因组职责范围映射可以通过两种方法来实现。第一种方法是上述的的BrdU-IP为基础的方法的基因组的版本，其中，所述量的量化在每个级分沉淀的DNA被用于通过杂交整个基因组，以微阵列或通过深度测序同时进行。第二种方法，CNR-TOR，基于由在G1期细胞的DNA含量测定S期细胞和正火的每个基因组区域的拷贝数。在该方法中，细胞通过FACS分类成非复制（G1期），并复制（S期）基团（ 图1）。在G1期细胞在所有的基因组区域的相同拷贝数和因此它们的DNA含量应该是相同的。另一方面，在S中的DNA拷贝数依赖于职责范围，因为早期复制区域中大多数细胞进行复制，因此，它们的DNA含量增加一倍，而晚复制区域没有在大多数细胞尚未复制，因此，它们的DNA含量将是类似的G1期细胞。因此，S键DNA含量的G1比例指示职责范围。 DNA的每个基因组区域的量测得的通过杂交要么芯片或深度测序2,8。的CNR-TOR方法的优点将被进一步讨论。
本文介绍在图2描述了基因组职责范围映射CNR-TOR方法。本文从收集细胞，直到结果的基本分析和基因组职责范围的地图的创建讨论的全过程的细节。在本文中描述的协议已经在培养中生长的各种细胞类型被成功执行。这个协议的未来的改进可导致职责范围体内的映射和在罕见的细胞类型。
Protocol
Representative Results
Discussion
CNR-TOR可以在原则上任何真核增殖细胞群，可以通过FACS对S和G1期（由莱因德N。和吉尔伯特DM 20中综述）被划分来执行。这里所描述的方法已被调整到哺乳动物细胞用〜3千兆的基因组大小如人和小鼠。在CNR-TOR协议的微小变化（在细胞制剂和测序深度）都需要，以便将其调整到其它真核生物。因为它是限速步骤必须注意到的足够量的S期的细胞的集合。因此，对于细胞周期的初步FACS…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢奥里亚瓦迪对生成的数字援助。在IS组的工作是由以色列科学基金会（批准号：十分之五百六十七）和欧洲研究理事会资助启动（＃281306）的支持。
Materials
| PBS | BI (Biological Industries) | 02-023-1A |
| Trypsin-EDTA | BI (Biological Industries) | 03-052-1B |
| 15ml conical tube | Corning | 430790 |
| 5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap | BD-Falcon | 352235 |
| Ethanol | Gadot | 64-17-5 |
| RNAse-A 10mg/ml | Sigma | R4875 |
| Propidiom iodide 1mg/ml | Sigma | P4170 |
| parafilm | Parafilm | PM-996 |
| 1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431021 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| 1.7ml MaxyClear tube | Axygen | MCT-175-C |
| magnetic beads – Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 |
| Ultrasonicator | Covaris | M-series -530092 |
| 50 µl microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm | Covaris | 520096 |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Invitrogen | Q32854 |
| Electrophoresis.2200 Tape station system | Agilent | D1000 ScreenTape |
| Seqeuncing – Illumina NextSeq system | Illumina | SY-415-1001 |
| Dneasy kit for DNA purification | Qiagen | 69504 |
| PureProteom Magnetic Stand | Millipore | LSKMAGS08 |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 |
| FACS sorter | BD | FACSARIA III |
| FACS software | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
Referencias
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