酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をUnravelling

1.感染アップルの木から根と葉のサンプルを収集注：病原体特異的DNAは、根または葉から精製することができます。次のセクションでは、両方のサンプリングのためのプロトコルを提供します。 DNA調製のために根からのサンプル採取および準備無症状である「りんご増殖」特有の症状30、31および制御の木が感染した木を特定します。 1 cmから約5cmの長さ – クリーン剪定ばさみを使用して、0.5の直径を有する根サンプルを切断します。カット根系の三つの異なる、離れた部位からのサンプル、および適切に標識されたビニール袋に入れて。 冷蔵熱パックとコールドボックス内のサンプルを維持し、さらなる処理まで4℃で冷蔵庫に保管してください。 注：ルートアーキテクチャと構造が生理学的状態のOに対して変化することができます木F。 3つの異なる部位でサンプリングすると、薄すぎると根を取るしないことが重要です。サンプルを、4℃で数日間保存することができるが、より長い貯蔵時間は、成形品のリスクを高めます。カビの生えたサンプルは、DNA調製のために使用することができません。 土壌を除去するために水で根サンプルをすすいでください。滅菌ペトリ皿に入れ、ルート表皮と皮質を除去するために滅菌メスを使用します。 70％（v / v）エタノール水溶液でそれを浸し、ワイプ、及び直火（ 例えば、ブンゼンバーナー）の上に、熱殺菌、清潔なリントフリーのティッシュでメスを清掃してください。滅菌した2.0 mLの反応管にみじん切り師部の100 mgの – 30、メスで師部を傷つけ小片にそれをチョップし、アリコート。数ヶ月のために-80℃でサンプルを保管してください。 葉からのサンプル採取および準備 、感染および無症候性のコントロールツリーを識別するsがステップ1.1.1.1に記載され、ツリーあたり10無傷の葉を選びます。条件ごとに一本の木で十分です。 水で葉を洗浄し、70％（v / v）のエタノール溶液を噴霧することにより表面を洗浄。滅菌ペトリ皿に葉を入れ、滅菌メスで各葉の中肋（中心静脈）を解剖。滅菌2.0 mLの反応管に主脈から表皮および皮質を外し、小片に中肋を切断し、中肋組織の一定量を100mg。数ヶ月のために-80℃でDNA調製や店舗のため、すぐにサンプルを使用してください。 注：100mgの部分に植物材料をアリコートにし、最終的にストレージのためにそれらを凍結すると便利です。各アリコートは、直接DNA調製のために使用することができます。凍結した植物材料が塊を形成する傾向があるので、冷凍植物材料を計量すると、面倒です。 2.臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）は、DNAの調製をベース<p class = "jove_contentは">注：DNAは、植物材料のための任意の列ベースのDNA精製方法を用いて精製することができます。このセクションでは、DNA精製のためのCTABベースの方法が記載されています。 DNA精製は、他の場所32記載の修飾されたプロトコルに基づいて行われます。 以下の緩衝液を準備します。 CTAB緩衝液：W / V臭化セチルトリメチルアンモニウム1％を溶解（CTAB、M rを：364.45グラム/モル）、100mMのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス、M rを：121.14グラム/ mL）を、1.4 M塩化ナトリウム（NaClのM個のR：58.44グラム/モル）、および20mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（のNaEDTA、M rを：372.24グラム/モル）を水で、それらは、pH 8.0に調整します。 N-ラウロイルサルコシンバッファ：ワット/ V N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩33（M rを：293,38グラム/モル）10％を溶解し、100 mMトリス、および水中の20mMののNaEDTAとpHを8.0に調整します。 トリスEDTA（TE）緩衝液：水とautoclに10 mMトリスおよび1mMのNaEDTAを溶かしますソリューションをaveの。 酢酸アンモニウム溶液：水に解決し、120℃で、それをオートクレーブし、20分間1.2バール：5 M酢酸アンモニウム（77,0825グラム/モルのM r）を準備します。 CTAB緩衝液の300μL、N-ラウロイルサルコシンバッファの30μL、プロテイナーゼKの6μL（10μgの/μL）、及び12μLの新鮮なまたは冷凍みじん切り植物材料（ステップ1.1.2.2。）の100ミリグラム – 30ミックス2-メルカプトエタノール34（M rを：78,13 /モル）。 60℃で60分間振とうします。ミックスが進む前に室温まで冷却してみましょう。 酢酸アンモニウム溶液の360μLを加え、激しく混合します。溶液を5分間放置し、次いで室温で10分間、15,000×gで遠心分離してみましょう。きれいなバイアルに上清を移し、氷冷イソプロパノール35の720μLを追加します。 -20℃で少なくとも30分間、DNAを沈殿させます。 4で30分間、15,000×gでミックスを遠心Cを°、上清を捨てます。氷冷70％エタノールの500μLでペレットを洗浄し、4℃で5分間、15,000×gでスピンダウン。 エタノール上清を捨て、すぐに残留する液滴を除去するために、清潔なペーパータオル上でバイアルを浸します。できるだけ多くの液体を除去することを確認します。真空濃縮機遠心機で15-20分間または2-3分間ペレットを空気乾燥します。過剰な加熱または拡張蒸着時間によってペレットを過剰乾燥させないでください。 TE緩衝液700μLにペレットを再懸濁し、最終的に溶解を容易にするために、37°C​​にそれをウォームアップ。 RNアーゼの10μL（10μgの/μL）を加え、300rpmで振とうしながら、37℃で15分間静置します。 36 24：イソアミルアルコール：クロロホルムの700μLを追加1、よく混ぜます。 4℃で10分間20,000×gでミックスを遠心して、新しい、きれいなバイアルに上澄み液の上相を転送します。 添加することによって、上清中のDNAを沈殿700μLの2-プロパノール35（イソプロパノール、M rを：60.1グラム/モル）および-20℃で少なくとも30分間インキュベートします。 4℃で30分間12,000×gでミックスを遠心し、上清を捨てます。 4℃で5分間、12,000×gで70％エタノールおよび遠心分離機の500μLでペレットを洗浄。ステップ2.5で説明したように、ペレットを乾燥させます。 TEの50μLでそれを溶解させます。 3. PCRによりCandidatusファイトプラズママリ特異的DNAの検出ヌクレアーゼフリー水で植物材料午前1時10分から精製したDNAを希釈し、病原体特異的プライマー37でPCRを実行します。 P.マリファイトプラズマ37のためのプライマーおよび特異的なプローブを用いた定量的PCRプロトコルを使用して植物材料におけるP.マリ特異的DNAの存在を確認します。 CAの各プローブと同じPCRを行うことにより、他の16SrXのファイトプラズマのメンバーが存在しないことを確認してくださいND。 P.のprunorumとCANDのため。 P.ピリDNA 37。 注：非感染ツリーからのDNAは、このコントロールの病原体が存在しないことを確認するためにも同様にテストする必要があります。このステップでは、それは、Pのマリ以外ファイトプラズマ種からエフェクタを増幅するリスクを増大させるため、他の密接に関連ファイトプラズマ種からのDNAは、試料には存在しないことが重要です。別の密接に関連したP.マリ16SrXグループファイトプラズマとの混合感染は、各プローブで試料を分析することによって除外されます。予想される結果は、他の16SrXのファイトプラズマについて陰性でなければならないので、PCRの有効性を示す適切な陽性対照を含めることが重要です。 4.潜在的なエフェクター遺伝子を増幅するとY2Hベイトベクターにサブクローニングプライマー5を用いマリP.のphytoplasmal遺伝子atp_00189（シグナルペプチド部分を含まない）を増幅-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3（順方向）及び5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3は、それぞれ、5 'および3'末端にEcoRIおよびSalIのための制限部位と、（逆）。列ベースのDNA精製方法を用いてPCR産物を精製します。 EcoRIおよびSalIでライゲーションを介し Y2HベイトベクターpLexA-Nにアンプリコンを複製します。 注：ここでは、EcoRIおよびSalIでの100 ngがpLexA-Nベクターは、同様にPCRアンプリコンおよび1 UのT4リガーゼatp_00189消化の15 ngのと合わせた直線化。ライゲーションは、（25℃でのpHは7.9）、40 mMトリス-塩酸を含む緩衝液中で実施した、10mMのMgCl 2を、10mMのジチオスレイトール（DTT、M rを：154.25グラム/モル）、および0.5mMアデノシン三リン酸（ATP、M R：16°Cで一晩（14-20時間）で10.0μLの総容量で507.18グラム/モル）。 マルスのx domesticaに結合する非特異的プライマーを除外するために、同じプライマーを用いて、感染していない木からDNAを分析</em>のDNA。 大腸菌エレクトロ細胞へのライゲーションミックスの1μLを変換および50μg/ mLのカナマイシン硫酸塩38を補充したルリア-ベルターニ（LB）プレート上のカナマイシン耐性クローンを選択。 製造者の指示に従ってカラムベースのプラスミドミニ調製キットと、選択した細菌クローンからプラスミドDNAを精製し、シークエンシング39によってインサートの統合を成功さや向きを確認してください。 潜在的なエフェクタータンパク質の自己活性化（自動起動）5.試験以下の緩衝液および増殖培地を準備します。 注：酵母選択プレートのハイフネーションのための命名法とそれぞれの培地中で不足しているアミノ酸の略語「 – 」の略語の前に。例えば、SD-TRP-レイ-彼のプレートは、すべてのアミノ酸が、TRP、レイと彼が含まれています。 10倍ドロップアウトミックス：計量L-アルギニン一塩酸塩200mgの（M rを：210.66グラム/モル）、L-イソロイシン300mgの（M rを：131.17グラム/モル）、L-リシン一水和物の269 mgの（M rを：164.21グラム/モル） L-メチオニン200mgの（M rを：149.21グラム/モル）、L-フェニルアラニン500mgの（M rを：165.19グラム/モル）、L-トレオニンを2g（M rを：119.12グラム/モル）、300mgのL-チロシンの（MR：181.19グラム/モル）、L-ウラシル（112.09グラム/モル）を200mg、およびL-バリン1.5gの（M rを：117.15グラム/モル）。二重蒸留水1Lにそれらを溶解し、溶液をオートクレーブ。 4℃で溶液を保管してください。 注：それぞれのドロップアウトミックスはまた、予混合を購入することができます。 10X L-アデニンサプリメント（ADE、M rを：184.17グラム/モル）L-アデニンヘミ硫酸塩100mgを秤量し、再蒸留水50mL中に溶解します。フィルターは、0.22μmの細孔フィルターで溶液を滅菌します。 10倍のL-ヒスチジン補足：L-ヒスチジン一塩酸塩一水和物100mgを秤量（HIS、M rを</suB>：二回蒸留水とフィルターの50ミリリットルで209.63グラム/モル）0.22μmの細孔フィルターでそれを滅菌します。 10倍のL-ロイシン補足：0.22μmのポアフィルタでそれを滅菌二重蒸留水とフィルター50mL中：L-ロイシン（113.17グラム/モルレイ、M r）この500mgのを計量。 10倍のL-トリプトファンサプリメントは：二回蒸留水50mLに、フィルターは、0.22μmの細孔フィルターでそれを滅菌する：L-トリプトファン（204.23グラム/モルのtrp、MをR）100mgを秤量します。 SD-TRP-レイ-彼-ADJ-培地とプレート：ダブルで：（アミノ酸を含まない）のV酵母窒素ベース/ wの0.67％を溶解し、2％のw / vのD-グルコース一水和物（198.17グラム/モルのM R）蒸留水とオートクレーブ。寒天プレートのために、オートクレーブ処理に先立って、V寒天（微生物学的グレード）/ wの2％を追加します。 選択プレートを製造するために、オートクレーブしたSD-TRP-レイ-彼-ADE培地にアミノ酸原液の1倍を追加します。プレートを調製する場合、追加する前に寒天を〜50℃に冷却されていることを確認しますアミノ酸。無菌のストック溶液を保管してください。 YPAD培地：にW / Vグルコース一水和物、2％、Vペプトン（微生物学的グレード）/ wの2％W / V酵母抽出物0.004重量/容量％のアデニンヘミ硫酸塩（184.17グラム/モルのM r）を 1％溶解二重蒸留水とオートクレーブ。 YPAD寒天プレートのために、オートクレーブの前にV寒天/ wの2％を追加します。 2倍YPADを準備するには、上記の成分の倍の濃度を使用しています。 注：（オプション）により培地中のグルコースの高濃度に、2倍YPAD培地はオートクレーブ処理した後、暗褐色になります。代替として、（w / v）のグルコースストック溶液を40％が0.22ミクロンフィルターに通すことにより調製し、滅菌することができます。フィルター滅菌グルコースストック溶液を滅菌条件下でオートクレーブ2×YPAD（欠くグルコース）に添加します。ボリュームのエラーを回避するために、2倍YPADは10倍のグルコース溶液が続いて添加されていることを念頭に置いて、準備しなければなりません。その手段は、例えば、代わりに、1 L oをそのF培地は、唯一の900 mLの（グルコースを除く全ての成分を含有する）を調製し、オートクレーブ処理し、次いでグルコースストック溶液の100mLを添加します。 テストの自己活性化のための酢酸リチウム媒介酵母形質転換ストリークサッカロマイセス・セレビシエレポーター株NMY51 40（NMY51：MATahis3Δ200trp1-901 leu2-3,112 ADE2 LYS2：:( lexAop）4-HIS3、URA3：:( lexAop）8-lacZをADE2：:( lexAop）8-ADE2 GAL4）からYPAD寒天プレート上のグリセロールストックを凍結し、30℃で48時間静置します。このプレートからコロニーを選択し、YPAD培地50 mLの接種。酵母が成長し、成長を監視するために定期的にOD 600を測定してみましょう。 酵母は0.5〜0.8の最終OD 600に成長しましょう。 5分間、700×gで、それらを遠心分離して細胞をペレット化し、二重蒸留、オートクレーブ処理水2.5 mL中に再懸濁します。 酵母懸濁液100μLで6アリコートを準備し、50の240μLを追加％w / vでポリエチレングリコール4000（PEG、M rを：3,500-4,000グラム/モル）、1 M酢酸リチウム二水和物の36μL（LiOAc、M rを：102.02グラム/モル）、およびw / vで2％の25μLサケ精子DNA（溶解）。二重蒸留、滅菌水で全ての試薬を準備します。 "" "F"から酵母懸濁液を含む6バイアルにラベルを付けて、次のプラスミドベクターDNA追加：ネガティブコントロールを：エフェクター（pLexA-N-atp00189 28）と餌プラスミドの（a）の1.5μgの、（b）は（c）は、空のベイトベクターpLexA-N 41、及び（d）の1.5μgの空のベイトベクターpLexA-N1.5μgの空獲物プラスミドpGAD-HA1.5μgの空の獲物プラスミドpGAD-HA 41、1.5μgの。陽性対照：（e）のポジティブコントロールベイトプラスミドDNA pLexA-p53の41と正獲物プラスミドPACT-largeT 411.5μgの1.5μgの。自己活性化試験：（f）はBAの1.5μgのそれは、空の獲物プラスミドpGAD-HAのエフェクター（pLexA-N-atp00189）と1.5μgのプラスミド。 激しく反応を混合し、水浴中で42℃で45分間それをインキュベートします。 700×gで5分間、細胞をペレット化し、上清を捨てます。以下の選択プレート上で50μLを広める：（48.44グラム/モルのNaCl、Mのr）と：0.9％の250μL（w / v）の塩化ナトリウム溶液中で細胞を再懸濁SD-TRP、SD-Leuで、SD-trp-レイ、SD-TRP-レイ – 彼、およびSD-TRP-レイ-彼エイド。 30℃で4日間 – 3用のプレートをインキュベートします。インキュベーションの最初の日の後、乾燥からプレートを防止するために、プラスチック製のパラフィンフィルムでプレートをシール。 プレート上の酵母の増殖を確認してください。 6.テストエフェクターの発現エフェクターときのN末端に結合されているLexのタグに対する抗体を用いてウェスタンブロット42によるエフェクターの発現をテストpLexA-Nから発現。 注：翻訳的に融合Lexのタグが目的のタンパク質の実際の重量は約24キロダルトンを追加することを検討してください。ウェスタンブロットでのタンパク質のサイズを特定する際に重要です。 7. Y2HスクリーンストリークpLexA-atp00189（エフェクター）は、新鮮なSD-TRPプレート上NMY51を-transformed、それは2のために成長させ – 赤いコロニーが出現するまで、30℃で3日間。 寒天プレートからの赤色コロニーと小さな揺れフラスコにSD-TRP培地の3ミリリットルを接種し、120で振とうしながら30℃で一晩インキュベート – 150 rpmで。 一晩培養物1mlで振とうフラスコ中のSD-TRPの20ミリリットルを接種し、それが8時間増殖してみましょう。 SD-TRP媒体を追加することで、600 = 0.2をODとスターター培養各10mLで振盪フラスコ中で2回100ミリリットルを接種するために文化を調整します。 30℃で振盪しながら一晩増殖。 注：酵母がOD 6に成長していないことを確認します00> 0.5、新鮮なSD-TRPで希釈します。 OD 600とペレット120 OD 600測定」を単位にしています。」 1.2のOD 600が測定されている場合、100ミリリットルをスピンダウンし、上清を捨て、および磁気攪拌棒を備えた振とうフラスコに予熱した2倍YPADの800 mL中にペレットを再懸濁。 2-mLのアリコートをスピンダウンし、上清を除去し、水にペレットを再懸濁。酵母懸濁液のOD 600が 0.15と0.2の間であることを確認してください。そうでない場合、2倍YPADで調整するか、一晩培養物からより多くの酵母を追加します。 注：2倍YPADは暗褐色であり、OD測定の結果に影響を与えることができます。したがって、ODを決定する前に水で酵母細胞を再懸濁することが必要です。代替として、2×YPAD媒体の暗い着色を防止するステップ5.1.8ノートに記載されているように、個別にグルコースを滅菌することにより調製することができます。 アプリ内に残っている酵母培養液をインキュベートropriately（2Lのシェーカーフラスコ中で800mLのか、2 1Lのシェーカーフラスコに2×400ミリリットルを分割）振とうフラスコをサイズにし、30℃、120でインキュベート – 150 rpmで。 OD 0.6の600に到達するまで、すべての1.5時間から約OD 600を測定します （4とり- 6時間）。一方で、次のステップで説明するソリューションを用意。 酢酸リチウム媒介形質転換水中でのw / vのサケ精子DNAを2％を溶解し、100℃の水浴中で5分間、500μLを沸かします。 2分間チューブを氷上に置き、加熱工程を繰り返します。さらに使用するまで氷上にDNAを保管してください。 以下のミックスを準備します。 TE / LiOACミックス：、および無菌の二重蒸留水21.84ミリリットル：1 M LiOACの3.08ミリリットル、100 mMトリス/ 10mMのEDTA（7.5のpH）の3.08ミリリットルを混ぜます。 PEG / LiOAcミックス：PEG 4000（w / v）であり、50％の33.6 mLの1 M LiOAcの4.2 mLを、mMトリス/ 10mMのEDTA（7.5のpH）の4.2ミリリットルを組み合わせます。 遠心分離機800-mLの酵母培養（OD 600 = 0.6）細胞をペレット化するため5分間、700×gで。上清を除去し、無菌の二重蒸留水200mLにペレットを再懸濁。 5分間、700×gで再び細胞をペレット化し、上清を捨てます。注：遠心操作するためのいくつかのバイアルに分周サスペンション必要な場合。 7.7.3内の液体のボリューム。および7.7.4。 800 mLの懸濁液から誘導されたペレット全体を参照してください。 TE / LiOAcミックスの16ミリリットルでペレットを再懸濁（ステップ7.7.1.1を参照）。 5分間、700×gでスピンダウンし、上清を捨てます。 TE / LiOACミックスの9.6 mL中にペレットを再懸濁。 pGAD-HA-cDNAライブラリーのベクトルの7μgの12バイアル、2％のサケ精子DNAの100μL（ステップ7.7を参照）、およびPEG / LiOAcミックスの2.5 mLの次の反応は、適切なサイズの反応ポリプロピレン容器を中に混合する準備します。 12バイアルの各々にステップ7.10から酵母細胞懸濁液600μLを加え、1分間激しく混合します。 水浴ANに30℃で45分間反応ミックスをインキュベート勢いよく15分毎に混ぜるdは。すべてのバイアルにDMSOの160μLを加え、激しく混合します。 42℃でさらに20分間混合物をインキュベートします。 、5分間700×gで細胞をペレット上清を捨て、そして2倍YPAD 3mLに各ペレットを再懸濁します。プールの100mLの振とうフラスコ内（12バイアルから36ミリリットルの合計）は、すべての細胞および30℃、120 rpmで90分間、酵母を培養すること。 700×gで5分間、細胞をペレット化し、上清を捨てます。滅菌0.9％の4.5ミリリットル（w / v）のNaCl中でペレットを再懸濁し、慎重に10-mLの血清学的ピペットで上下にピペッティングによりよく混ぜます。 50μLを撤回し、1までの午前1時10分から0.9％NaCl中の十倍希釈液を準備：1,000。 SD-TRP-レイ寒天を含む90 mmのペトリ皿上の各希釈のプレート100μL。 SD-TRP-レイ-彼-ADE寒天で16×150 mmの直径のペトリ皿上で希釈されていない酵母の再懸濁の残りの部分を広げます。自己活性化を低減するために培地に3-ATを追加します。 SD-TRP-レイをインキュベート30℃で4日間、3日間のプレートとSD-TRP-レイ-彼エイドプレート。 注：選択プレート上に表示されたクローンは、（潜在的な）相互作用ペアであり、餌相互作用パートナーのためのpGAD-HAプラスミドコーディングを運びます。 SD-TRP-レイ選択プレート上の異なる連続希釈液のコロニーをカウントすることにより、トランスフェクション効率を決定します。新鮮なSD-TRP-レイ-彼-ADJ-選択プレート上で無菌ピペットチップでコロニーをピッキングし、ストリーキングによって各クローンを転送します。 30℃で24時間プレートをインキュベートします。 5通路の合計に達するまで毎日、この手順を繰り返します。 選択プレートからのクローンの8解析無菌フードの下で各クローンのためのSD-TRP-レイ-彼-ADE 1mLで1滅菌2ミリリットルの反応管を準備します。ホット針で各チューブに穴をパンチし、ガス透過性シーラーの切れ端で穴をカバーしています。新鮮なコロニーメイトとの各バイアルに接種一つのクローン（ステップ7.17; 5 回目の通過後にクローンを使用）からのリアルさせ、回転数150rpmで振盪しながら、30℃で24時間インキュベート。 注：4℃で数日間保存されたプレートから採取した酵母は、液体培地中で24時間以内に十分に増殖しないので、それは新鮮なプレートからのクローンを取ることが重要です。 4,000×gで5分間、酵母をペレット化し、上清を捨てます。 （それぞれのプラスミドDNAミニプレップキットからの）適切な再懸濁緩衝液中にペレットを再懸濁し、新鮮な2.0 mLの反応管に移します。酸洗浄したガラスビーズ（425- 600ミクロンまでの直径）の100μLを加え、5分間激しく混合します。 それぞれの溶解バッファーを追加し、製造者の指示に従ってプラスミド調製ミニキットを用いてプラスミド精製を進めます。 50μLの水でプラスミドDNAを溶出します。 獲物プラスミド特異的プライマー、GAL4ADseqとの配列決定反応のためのステップ8.3からDNAを使用しますREF "> 41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3」。 同時変換デノボによって相互作用43、44ベイトおよびプレイベクターを確認します。 SD-TRP-レイ-彼-ADE選択プレート上で形質転換した酵母を選択します。