תאי גזע פלוריפוטנטיים נגזרים תאי לב לתיקון שריר לב
Summary
אנו מציגים שלושה פרוטוקולי רומן ויעילים יותר להבחנה תא גזע מושר אנושי לתוך cardiomyocytes, תאי אנדותל, ותאי שריר חלק ו שיטת הצגה המשפר את engraftment של תאים מושתלים על ידי שילוב הזרקת תא עם משלוח ציטוקינים בתיווך תיקון.
Abstract
תאים אנושיים המושרה גזע פלוריפוטנטיים (hiPSCs) חייב להיות מובחן במלואו לתוך סוגי תאים מסוימים לפני הממשל, אך פרוטוקולים קונבנציונאלי להבחנה hiPSCs לתוך cardiomyocytes (hiPSC-CMS), תאי אנדותל (hiPSC-ECS), ותאי שריר חלק (SMCs) הם בדרך כלל מוגבל על ידי תשואה, טוהר נמוך, ו / או יציבות פנוטיפי עניה. כאן, אנו מציגים פרוטוקולי רומן להפקה hiPSC-CMS, -ECs, ו -SMCs כי הם משמעותיים יותר יעילים מאשר שיטות קונבנציונליות, כמו גם שיטה משלבת הזרקת תא עם טלאי ציטוקינים המכילים נוצרו על האתר של ממשל. המדבקה משפר הן את שימור של התאים מוזרקים, על ידי איטום המסלול מחט כדי למנוע את התאים מפני סחט של שריר הלב, והישרדות התא, על ידי שחרור גורם גדילה דמוי אינסולין (IGF) על פני תקופה ארוכה. במודל החזירים של פגיעה איסכמיה-רה-פרפוזיה בשריר הלב, קצב engraftment היה יותר משני-לקפל יותר כאשרתאים נוהלו עם המדבקה המכיל ציטוקינים בהשוואה לתאים ללא תיקון, וטיפול בשני התאים ואת התיקון, אך לא עם התאים לבד, היה קשור לשיפור בתפקוד לב וגודל אוטם.
Introduction
אדם מושרה בתאי גזע פלוריפוטנטיים (hiPSCs) הם בין סוכני המבטיחים ביותר עבור טיפול בתאי משובים כי הם יכולים להיות מובחנים לתוך מגוון בלתי מוגבל פוטנציאל וכמות התאים שאינם נדחה על ידי המערכת החיסונית של החולה. עם זאת, את יכולת שכפול עצמי והבחנה יכול גם להוביל להיווצרות גידולים, וכתוצאה מכך, hiPSCs צריך להיות מובחן במלואו לתוך סוגי תאים מסוימים, כגון cardiomyocytes (CMS), תאי האנדותל (EC), ותאי שריר חלק (SMCs ), לפני מתן. אחת השיטות הפשוטות והנפוצות ביותר של ממשל תא הוא הזרקת intramyocardial ישירה, אך מספר תאים מושתלים כי הם engrafted ידי רקמת שריר לב הוא היליד נמוך באופן חריג. הרבה התשה זו ניתן לייחס לסביבה ציטוטוקסיות של הרקמה איסכמי; עם זאת, כאשר תאי גזע בעכברים עובריים (ESCs) מוזרקים היו ישירות לתוך שריר הלב של לב וללא כל פגע, only ~ 40% של 5 מיליון התאים נמסרים נשמרו במשך 3-5 שעות 1, אשר טוענת כי חלק ניכר של התאים המנוהלים יצא אתר הממשל, אולי משום שהם היו סחטו דרך מסלול המחט ידי בלחצים הגבוהים הנוצרים במהלך התכווצות שריר הלב.
כאן, אנו מציגים שיטות חדשניות והרבה יותר יעילות להפקה cardiomyocytes hiPSC הנגזרת (hiPSC-CMS) 2, תאי אנדותל (hiPSC-ECS) 3, ותאי שריר חלק (SMCs) 4. יש לציין, פרוטוקול hiPSC-SMC זה הוא ראשון לחקות את המגוון הרחב של מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים שנצפו סומטיים SMCs 5 על ידי הפניית התאים כלפי פנוטיפ SMC סינטטי או תנועתיים בעיקרה. כמו כן אנו מספקים שיטה של משלוח תא המשפר את קצב engraftment של התאים מוזרקים על ידי יצירת p הפיברין המכילים ציטוקיניםAtch על הזריקה. המדבקה מופיע כדי לשפר הן החזקת התא, על ידי איטום המסלול מחט כדי למנוע את התאים מפני היציאה שריר הלב, והישרדות התא, על ידי שחרור גורם גדילה דמוי אינסולין (IGF) על פני תקופה של שלושה ימים לפחות.
Protocol
Representative Results
Discussion
תשואה / טוהר משופר של hiPSC-CMS
פרוטוקולים קונבנציונליים להבחנה תא גזע אנושי לתוך CMS מוגבלים לעתים קרובות על ידי תשואה נמוכה וטוהר; למשל, רק 35-66% של hESC-CMS שהושגו באמצעות הפרדת Percoll היווצרות גוף לב הביעו שרשרת כבדת שרירן איטית או cTnT <sup class="xr…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).
Materials
| Protocol 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-ß | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-ß | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
 -aminocaproic acid |
Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
Referencias
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
