Genome-wide analys av HDAC-hämmare-medierad modulering av mikroRNA och mRNA i B celler förmås att genomgå klass-switch DNA-rekombination och Plasma celldifferentiering
Summary
Epigenetiska faktorer kan interagera med genetiska program att modulera genuttryck och reglera B cellsfunktion. Genom att kombinera in vitro B-cell stimulering, qRT-PCR, och hög genomströmning mikroRNA-sekvens och mRNA-sekvens tillvägagångssätt, kan vi analysera de epigenetiska moduleringen av miRNA och gen uttryck i B-celler.
Abstract
Antikroppssvar är fulländade genom flera kritiska B cell-inneboende processer, inklusive somatisk hypermutation (SHM), klass-switch DNA-rekombination (CSR) och plasma celldifferentiering. Under de senaste åren har epigenetiska modifieringar eller faktorer, såsom Histon deacetylering och mikroRNA (Mirna), visats interagera med B-cells genetiska program till formen antikroppssvar, medan dysfunktion av epigenetiska faktorer har visat sig leda till autoantikropp svaren. Analysera genome-wide miRNA och mRNA uttryck i B-celler som svar på epigenetisk modulatorer är viktigt för att förstå epigenetisk reglering av B-cells funktion och antikropp svar. Här visar vi ett protokoll för inducerande B-celler genomgår CSR och plasma cell differentiering, behandling av dessa B-celler med Histon histondeacetylas (HDAC)-hämmare (HDI) och analysera mRNA och mikroRNA uttryck. I detta protokoll, analyserar vi direkt kompletterande DNA (cDNA) sekvenser med nästa generations mRNA sekvensering (mRNA-seq) och miRNA-seq teknik, kartläggning av sekvensering läser till genomet och kvantitativa omvänd Transkription (qRT)-PCR. Med dessa metoder, har vi fastställt att, i B-celler inducerad genomgå CSR och plasma celldifferentiering, HDI, en epigenetisk regulator, selektivt modulerar miRNA och mRNA uttryck och förändrar CSR och plasma cell differentiering.
Introduction
Epigenetiska märken eller faktorer, såsom DNA-metylering, Histon posttranslationell ändringar och icke-kodande RNAs (inklusive mikroRNA), modulera cellens funktion genom att ändra gen uttryck1. Epigenetiska förändringar reglera B-lymfocyter funktion, till exempel immunglobulin klass-switch DNA-rekombination (CSR), somatisk hypermutation (SHM) och differentiering till B-minnesceller eller plasmaceller, därigenom modulera den antikropp och autoantikroppar svar2,3. CSR och SHM kräver kritiskt aktivering-inducerad cytidindeaminas (stöd, kodad som Aicda), som mycket framkallas i B-celler som svar på T-beroende och T-oberoende antigen4. Klass-bytte/hypermutated B-celler ytterligare differentieras till plasmaceller, som utsöndrar stora mängder antikroppar i ett mode som är kritiskt beroende av B-lymfocyter-inducerad mognad protein 1 (Blimp1, Prdm1-kodad)5. Onormala epigenetiska förändringar i B-celler kan leda till avvikande antikropp/autoantikroppar svar, vilket kan leda till allergisk reaktion eller autoimmunitet1,4. Förstå hur epigenetiska faktorer, såsom MicroRNA, modulera B cell-inneboende genuttryck är inte bara viktigt för utvecklingen av vaccin, men är också viktigt att avslöja mekanismerna av potentiella onormala antikroppar/autoantikroppar svaren.
Histon acetylering och deacetylering är ändringar av lysin rester på Histon proteiner normalt katalyseras av Histon kolinacetyltransferas (HAT) och Histon histondeacetylas (HDAC). Dessa ändringar leder till ökande eller minskande tillgänglighet av kromatin och ytterligare tillåta eller förhindra bindning av transkriptionsfaktorer eller proteiner till DNA och förändringen av genen uttryck5,6, 7 , 8. HDAC-hämmare (HDI) är en klass av föreningar som stör funktionen av HDAC. Här, brukade vi HDI (VPA) adress regleringen av HDAC på inneboende gen uttryck profilen av B-celler och på dess mekanism.
MicroRNA är små, icke-kodande RNAs cirka 18 till 22 nukleotider i längd som genereras genom flera stadier. miRNA värd gener transkriberas och bilda hårnål primära mikroRNA (pri-MicroRNA). De exporteras till cytoplasman, där pri-MicroRNA vidarebearbetas till föregångare MicroRNA (pre-MicroRNA). Slutligen bildas mogna MicroRNA genom klyvning av den pre-microRNA. MicroRNA igen de kompletterande sekvenserna inom 3′ oöversatta regionen av deras mål mRNA6,7. Genom post-transcriptional ljuddämpning, reglera MicroRNA cellulär aktivitet, såsom proliferation, differentiering och apoptos10,11. Eftersom flera MicroRNA kan rikta samma mRNA, och en enda miRNA kan potentiellt rikta flera mRNA, är det viktigt att ha en sammanhangsberoende utsikt över miRNA uttryck profilen att förstå värdet av enskilda och kollektiva effekten av microRNA. MicroRNA har visat sig vara inblandade i B-cells utveckling och perifera differentiering, samt B-cellen scenen-specifika differentiering, antikroppssvar och autoimmunitet1,4,9. I de 3′ UTR Aicda och Prdm1finns det flera validerade eller förutsedd evolutionärt bevarade webbplatser som kan riktas av MicroRNA8.
Epigenetiska modulering, inklusive Histon efter transkriptionen modifiering och MicroRNA, Visa ett cell-typ och cellen scenen-specifik förordning mönster av gen uttryck9. Här, beskriver vi metoder för att definiera HDI-medierad moduleringen av miRNA och mRNA uttryck, CSR och plasma celldifferentiering. Dessa inkluderar protokoll för att inducera B-celler genomgår CSR och plasma celldifferentiering; för behandling av B-celler med HDI; och för att analysera miRNA och mRNA uttryck av qRT-PCR, miRNA-seq och mRNA-seq10,11,12,8,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet ger omfattande strategier för att framkalla B cell klass växling och plasma celldifferentiering; att analysera deras inverkan av epigenetiska modulatorer, nämligen HDI; och för att påvisa effekten av HDI på mRNA och miRNA uttryck i dessa celler. De flesta av dessa metoder kan också användas för att analysera effekterna av epigenetiska faktor på mänskliga B-cells funktion och mRNA/miRNA uttryck. De qRT-PCR och mRNA-seq/miRNA-seq metoder kan också användas för att analysera B-celler som i…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd av NIH grants AI 105813 och AI 079705 (till PC), bevilja alliansen för Lupus forskning Target identifiering i Lupus Grant ALR 295955 (till PC) och artrit National Research Foundation forskningen (HZ). TS stöddes av Pediatrics Medical Center, andra Xiangya sjukhuset, Central South University, Changsha, Kina, i samband med Xiangya-UT skolan läkemedel San Antonio medicinsk student besöker programmet.
Materials
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific – Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
Referencias
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
