Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
risposta adattativa è cruciale per la sopravvivenza dei batteri. Al fine di rilevare e rispondere a cambiamenti ambientali, batteri usano un sistema stimolo-risposta nota come segnalazione bicomponente. 1,2 In un tipico sistema a due componenti, la chinasi istidina rileva uno stimolo affine, autophosphorylates suo residuo istidina conservati, poi trasferisce fosfato ad un residuo aspartato conservati nel dominio ricevente di una proteina regolatore di risposta. 3 Questo evento attiva un cambiamento nell'attività del regolatore di risposta, che stimola un effetto valle. 4,5 Così, i batteri sono in grado di rilevare e adattarsi ai cambiamenti nell'ambiente locale. Alcuni sistemi di segnalazione a due componenti si discostano da questo archetipo. In alcuni casi, il dominio sensoriale della chinasi istidina è una proteina stand-alone, che rileva direttamente l'input sensoriale e modifica attività chinasica attraverso una interazione proteina-proteina. 6-8 Tuttavia, il fondoprocesso amental e il ruolo globale del sistema rimane lo stesso. segnalazione bicomponente è un sistema stimolo-risposta onnipresente che è essenziale per la sopravvivenza dei batteri, e chinasi istidina giocano un ruolo critico nella trasduzione del segnale. 9
Nonostante l'importanza di istidina chinasi alla biologia batterica, rimangono poco caratterizzato. Ciò è dovuto alla instabilità intrinseca di phosphohistidine, e la mancanza di un metodo pratico per misurare autofosforilazione. Phosphohistidine è più labile di Fosfoserina, phosphothreonine, e fosfotirosina. 10 Così, le tecniche che vengono comunemente utilizzati per analizzare chinasi Ser / Thr / Tyr non sono applicabili per chinasi istidina. 11 saggi in vitro per lo studio chinasi istidina sono stati in gran parte limitato a SDS-PAGE autoradiografia. 12,13 In questo metodo, [γ- 32 P] -ATP viene incubata con chinasi, e la fosforilazione della chinasi viene analizzato dal polgel yacrylamide elettroforesi (PAGE) seguita da autoradiografia del gel. Questo metodo può essere usato per monitorare autofosforilazione chinasi, nonché phosphotransfer dalla chinasi ad un regolatore di risposta. Tuttavia, questo metodo ha notevoli carenze. test basato sulla pagina sono bassa produttività e che richiede tempo. Tali limitazioni non sono favorevoli a caratterizzare una proteina e accertare i parametri cinetici. Un metodo alternativo per lo studio chinasi istidina che è stato pubblicato di recente utilizza anticorpi per rilevare phosphohistidine autofosforilazione. 14 Mentre questo metodo ha il vantaggio di distinguere tra 1-phosphohistidine e 3-phosphohistidine, a seconda della strumentazione utilizzata per il rilevamento, questo metodo non può offrire una vasta gamma dinamica o limite superiore alta di rilevamento. Pertanto, vi è la necessità per un saggio rapido, meno faticoso e più sensibile che può essere usato per studiare queste proteine importanti.
Qui, descriviamo e demonstrate un saggio di legame nitrocellulosa accuratamente sviluppato che può essere utilizzato per quantificare autofosforilazione di purificati chinasi istidina batteriche in vitro. Questo saggio è un throughput più elevato e meno tempo rispetto test basato sulla pagina. Il metodo utilizza anche la radiazione Cherenkov per phosphohistidine quantificazione, che offre un elevato limite superiore di rilevazione e una vasta gamma dinamica. Il saggio può essere utilizzato per determinare i parametri cinetici per chinasi istidina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il saggio di legame nitrocellulosa che abbiamo descritto ha molti vantaggi rispetto ai metodi utilizzati in precedenza per caratterizzare chinasi istidina. Rispetto ai tradizionali SDS / PAGE autoradiografia-based, il nostro metodo è maggiore produttività e meno tempo. La membrana di nitrocellulosa è facile da gestire rispetto gel SDS, e non deve essere fissato. Ponceau macchiare la nitrocellulosa consente per le macchie di proteine per essere visualizzati. Questo fornisce un modo semplice per tagliare ogni spo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Pubblica Istruzione attraverso l'assistenza Laurea in Aree di programma di fabbisogno nazionale (P200A100044).
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
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