Den voksne Drosophila hjerne er et værdifuldt system til at studere neuronal kredsløb, højere hjernefunktioner, og komplekse lidelser. En effektiv metode til at dissekere hele hjernevæv fra den lille flue hoved vil lette hjerne-baserede undersøgelser. Her beskriver vi en enkel, et-trins dissektion protokol af voksne hjerner med velbevaret morfologi.
Der er en stigende interesse i at bruge Drosophila at modellere menneskelige hjerne degenerative sygdomme, kort neuronale kredsløbssystemer hos voksne hjerner, og studere det molekylære og cellulære grundlag af højere hjernefunktioner. En hel-mount forberedelse af voksne hjerner med velbevaret morfologi er afgørende for sådanne hele hjernen-baserede undersøgelser, men kan være teknisk udfordrende og tidskrævende. Denne protokol beskriver en nem at lære, et-trins dissektion tilgang af en voksen flue hoved på mindre end 10 s, medens den intakte hjerne er fæstnet til resten af kroppen for at lette efterfølgende forarbejdningstrin. Proceduren hjælper med at fjerne de fleste af øjet og trakeale væv normalt er forbundet med hjernen, der kan forstyrre den senere billedbehandling trin, og placerer også mindre krav til kvaliteten af de dissekere pincet. Derudover beskriver vi en simpel metode, der tillader bekvem flipping af de monterede hjerneprøver på et dækglas, hvilket er vigtigt til afbildning begge sider af bregnskyl med lignende signal intensitet og kvalitet. Som et eksempel på protokollen, vi fremlægge en analyse af dopaminerge (DA) neuroner i voksne hjerner WT (w 1118) fluer. Den høje effektivitet af dissektion metode gør det især nyttigt for store voksne hjerne-baserede studier i Drosophila.
Modellen organisme Drosophila, almindeligvis kendt som bananfluen, har længe været værdsat for sine elegante genetiske værktøjer, korte reproduktive gange, og stærkt bevaret molekylære og cellulære veje. Bananfluen er blevet anvendt med held til at dissekere grundlæggende signalveje, mønstret mekanismer flercellede organismer, såvel som mekanismerne bag neuronal udvikling, funktioner og sygdomme 1,2. Med de seneste fremskridt inden for celle mærkning og imaging teknologier, har bananfluen hjernen bliver særligt effektiv i fin kortlægning af neuronal kredsløb og i at dissekere den molekylære og cellulære grundlag af højere hjernefunktioner, såsom indlæring og hukommelse, og døgnrytme 1,3, 4,5,6,7,8.
En særlig fordel ved Drosophila-systemet er dets relativt lille størrelse, hvilket tillader hel-mount fremstilling og undersøgelse af hjernen under anvendelse af en almindelig forbindelse eller konfokal mikroskop. This funktion giver detaljerede anatomiske og funktionelle analyser af neuronal kredsløb, eller endda en enkelt neuron, ved cellulære og subcellulære niveauer, i forbindelse med en hel hjernevæv, hvilket giver både et holistisk syn på den undersøgte genstand og dens præcise geometri i hele hjerne. Men i betragtning af den temmelig miniature størrelse af hjernen, præsenterer det også en teknisk udfordring i effektivt dissekere en intakt hjernevæv ud af den beskyttende exoskeleton hoved sagen i en voksen flue. Forskellige effektive og relativt simple dissektion metoder er blevet beskrevet i detaljer, som normalt involverer omhyggelig og trinvis fjernelse af hovedet sagen og de tilknyttede væv, herunder øjnene, luftrør, og fedt fra hjernen ordentlig 9, 10. Disse mikrokirurgiske dissektionsmetode Placer ofte ret strenge krav til kvaliteten af de dissektion pincet, bygger på pincet med fine godt alliancefrie tips, der let kan beskadiges. Da de dissekerede hjerner ofte separatelyed fra resten af kroppen, kan hjerner let tabt under de efterfølgende farvning og vaskeprocesser grund af deres små størrelser og deres gennemsigtighed i behandlingen buffer. Her beskriver vi en relativt simpel og nem at lære, et-trins dissektion protokol for voksne hjerner, der holder de dissekerede hjerner knyttet til torsoen. Den dissektion proces ofte let rydder væk de fleste af hjernen-associerede væv, såsom øjet og luftrøret og reducerer behovet for god kvalitet dissektion pincet.
Derudover, når billeddannelse af hjernen under fluorescerende forbindelse mikroskop eller konfokalt mikroskop, den side af hjernen, der er væk fra den fluorescerende lyskilde frembringer ofte et svagere signal og mindre klare billeder på grund af tykkelsen af hele-mount hjernen. Her beskriver vi også en enkel montering metode, der muliggør let flipping af hjerneprøver, hvilket muliggør bekvem billeddannelse af begge sider af hjernen med lignende signal intensiveretty og kvalitet.
Som en proof-of-concept for anvendelsen af denne metode til at studere den voksne hjerne, vi yderligere undersøgt tilstedeværelsen af DA neuroner i hjernen på w 1118 fluer; en genotype, som ofte anvendes som den parentale linje til generering af transgene fluer og vildtype kontrol i mange Drosophila undersøgelser.
Med en stigende interesse i at bruge voksne Drosophila hjernen til at studere humane hjernesygdomme, neuronal kredsløb og højere hjernefunktioner, er det nødvendigt at udvikle enkle og hurtige metoder til at opnå intakte flyve hjerner for hel-mount analyser, hvilket er særligt vigtigt for stor- skalere hjerne-baserede skærme. Vores metode giver en enkel og nem at lære tilgang at dissekere en flue hoved (ofte på mindre end 10 s med erfaring) med velbevaret morfologi, der er i høj grad ryddet for tilknyt…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Mr. Enes Mehmet, Ms Kiara Andrade, Ms Pilar Rodriguez, Chris Kwok, og Ms. Danna Ghafir for deres enorme støtte til projektet.
w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
Zen lite software | Quote |