Produktion och administrering av terapeutiska mesenkymala stam / Stromacells- (MSC) sfäroiderna Primed i 3-D kulturer Under Xeno fria förhållanden

Mesenkymala stamceller / stromaceller (MSC) har visat stor potential för olika regenerativ medicin metoder. MSC ursprungligen isolerades som en stromal komponent i benmärgen, men har sedan dess erhållits från många andra vuxna vävnader, inklusive fettvävnad ^{en, två, tre.} Intressant nog omfattar huvudisoleringsmetoden den anmärkningsvärda egenskapen hos MSCs att vidhäfta stadigt på vävnadsodlingsplast i närvaro av fetalt bovint serum (FBS). Även om detta traditionella isoleringsteknik medger enkel och snabb expansion av MSC i tvådimensionell (2D) kultur, är det också mycket artificiell och bortser betydelsen av nativa tredimensionella (3D) miljö som leder till potentiell förlust av viktiga cellegenskaper ^{4, 5 , 6.} Därför studiet av MSCs i 3D-kulturer, somär mer fysiologiska än traditionella 2D kulturer, har dykt upp i sökandet efter "förlorade / minskade" MSC egenskaper. Dessutom har ett stort intresse ökat för att identifiera Xeno Fritt (XF) kemiskt definierade villkor för MSC kultur och aktivering, och därmed göra cellerna mer mottagliga för kliniska tillämpningar.

Många studier har publicerats som visar 3D-kulturen i MSC både i biomaterial och som sfäriska aggregat eller sfäroider. MSC i biomaterial ursprungligen avsedd för vävnadstekniska metoder för att ersätta skadade vävnader med cell seedade ställningar, medan sfäroida kulturer av MSC sågs som ett sätt att förstå MSC beteende in vivo efter administrering av cellerna för behandlingar i prekliniska och kliniska prövningar ^{4, 5, 7.} Intressant MSC bildar sfäroider spontant när vidhäftning till vävnadsodlingsplast är inte tillåtet^{8, 9, 10.} Traditionellt har cell aggregering underlättas genom spinnerflaska metoder eller flytande tekniker overlay, metoder som används initialt i cancerbiologi i arbetet med att försöka efterlikna tumörmikromiljö. På senare tid har ytterligare metoder dykt upp som visar cell aggregering i odlingsskålar i förväg belagd med specifika kemikalier för att förhindra cell-till-plast vidhäftning ^{4, 5, 6.} Ett av de enklaste och mest ekonomiska metoder för att generera MSC sfäroider är att odla dem i hängande droppar, en teknik som ofta användes för att producera embryoidkroppar från embryonala stamceller. Med hängande droppe odlingstekniken, är cellvidhäftning till vävnadsodlingsplast förhindras genom att suspendera cellerna i en droppe medium på undersidan av en vävnadsodlingsskål lock och låta tyngdkraften för att underlätta cell aggregation i apex av droppen. Sfäroiddiametern storlek kan lätt manipuleras genom att ändra cellkoncentrationen eller den droppvolymen, vilket gör hängande droppe kulturer speciellt lätt att kontrollera.

Tidiga studier på 3D kultur MSC visade radikala skillnader i egenskaper hos cellerna i 3D jämfört med sina 2D motsvarigheter ^{6, 8, 9.} Samtidigt, rapporter visat att de gynnsamma effekterna av MSC: er in vivo förlitat sig på deras förmåga att bli aktiverad av mikromiljö signaler och som svar, för att producera anti-inflammatoriska och immunmodulerande faktorer ^11. Intressant nog många av dessa faktorer såsom prostaglandin E2 (PGE2), tumörnekrosfaktor-stimulerad gen 6 (TSG6), och hepatocyte growth factor (HGF) producerades i mycket större mängder av MSC spheroids än traditionella 2D MSC banar väg för idé ommed hjälp av 3D-kulturer för att aktivera cellerna ^{8, 12, 13.} Dessutom genaktivering i 3D-kulturer tycktes rekapitulera mekanismer, åtminstone delvis, av cellaktivering efter injektion i möss ^12. Genom att aktivera MSCs innan deras användning i experiment, kan effekterna av cellerna förlängas och mer framträdande som den traditionella MSC effekt in vivo är ofta försenade och övergående, och kan beskrivas som "hit and run". Under de senaste åren har viktiga funktionella studier med användning av MSC sfäroider visat att de kan undertrycka inflammatoriska reaktioner och modulera immunitet in vivo genom att påverka effektorceller såsom makrofager, dendritiska celler, neutrofiler och T-celler gör sfäroider en attraktiv form av primade MSC ^{2 , 3.} Dessutom produktion av anti-cancermolekyler, såsom interleukin-24 (IL-24) och tumömekrosfaktor-relaterad apoptosinducerande ligand (TRAIL), ökar i 3D-kulturer av MSCs i förhållande till monoskiktet MSC: er, ett fenomen som skulle kunna utnyttjas för riktade cancerterapier ^{8, 10, 14.}

Som den traditionella MSC kultur krävs inte bara användningen av vävnadsodling plast men också FBS till en annan hinder gör MSC sfäroider mer mottaglig för klinisk användning hade övervinnas. Att ta itu med detta hinder, vi nyligen visade bildandet av MSC sfäroider under specifika kemiskt definierade XF förhållanden och konstaterat att de resulterande MSC sfäroiderna aktiverades för att producera samma anti-inflammatoriska och anti-cancermolekyler som sfäroiderna genereras under förhållanden med FBS ^14. Här är dessa resultat presenteras i flera detaljerade protokoll som visar genereringen av föraktiverade MSCs i 3D kulturer använder XFmedia. Dessutom är protokoll presenteras som beskriver effektiva sätt att bedöma aktiverings nivåer av MSCs i avseende på deras anti-inflammatoriska, immunmodulerande och anti-cancer effekter, tillsammans med en praktisk metod för att leverera intakta sfäroiderna i möss.