Herstellung und Verabreichung von therapeutischen mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen (MSC) Sphäroiden Primed in 3-D-Kulturen unter Xeno freien Bedingungen

Mesenchymale Stammzellen / Stromazellen (MSCs) sind für verschiedene regenerative Medizin Ansätze großes Potenzial gezeigt. MSCs wurden zunächst als stromal Komponente von Knochenmark isoliert wurden , da aber von zahlreichen anderen adulten Geweben erhalten worden sind , einschließlich Fettgewebe ^{1, 2, 3.} Interessanterweise umfasst der Hauptisolationsverfahren die bemerkenswerte Eigenschaft von MSCs fest auf Gewebekulturkunststoff in Gegenwart von fötalem Rinderserum (FBS) zu haften. Während dieses traditionelle Isolationstechnik eine einfache und schnelle Expansion von MSCs ermöglicht in zweidimensionalen (2D) Kultur, ist es auch sehr künstlich und mißachtet Bedeutung der nativen dreidimensionalen (3D) Umgebung zu möglichen Verlust von wichtigen zellulären Eigenschaften führende ^{4, 5 , 6.} Daher ist die Untersuchung von MSCs in 3D-Kulturen, diesind physiologische als herkömmliche 2D-Kulturen, hat für "verloren / verminderte" MSC Merkmale auf der Suche entstanden. Xeno-frei (XF) chemisch definierte Bedingungen für die MSC Kultur und Aktivierung, zu identifizieren und somit machen die Zellen besser geeignet für klinische Anwendungen Zudem hat großes Interesse gestiegen.

Viele Studien sind veröffentlicht worden, die 3D-Kultur von MSCs zeigen sowohl in Biomaterialien und als sphärische Aggregate oder Sphäroide. MSCs in Biomaterialien wurden zunächst für das Tissue Engineering Ansätze entwickelt , beschädigte Gewebe mit Zell ausgesät Gerüste zu ersetzen, während Sphäroid – Kulturen von MSCs als eine Möglichkeit gesehen wurden MSC Verhalten in vivo nach der Verabreichung der Zellen für Therapien in präklinischen oder klinischen Studien zu verstehen , ^{4, 5, 7.} Interessanterweise spontan Sphäroiden MSCs bilden sich, wenn die Einhaltung der Gewebekultur-Plastik ist nicht zulässig^{8, 9, 10.} Traditionell wurde die Zellaggregation durch Rührflasche Methoden oder flüssigen Overlay-Techniken erleichtert, Methoden zunächst in der Krebsbiologie bei den Bemühungen um zu versuchen, den Tumor-Mikroumgebung zu imitieren. In jüngerer Zeit wurden weitere Methoden taucht , die Zellaggregation in Kulturschalen vorbeschichtet mit spezifischen Chemikalien zeigen zu verhindern Zelle zu Kunststoffhaft ^{4, 5, 6.} Eine der einfachsten und wirtschaftlichsten Verfahren MSC Sphäroide zu erzeugen, ist zur Kultur sie in hängenden Tropfen, eine Technik, die häufig verwendet wurde embryoid bodies aus embryonalen Stammzellen zu erzeugen. Mit hängenden Tropfen Kulturtechnik, die Zellhaftung an den Gewebekulturkunststoff wird durch Suspendieren der Zellen in einem Tropfen des Mediums auf der Unterseite einer Gewebekulturschale Deckel verhindert und damit die Schwerkraft zu erleichtern Zelle AGGREGation in der Spitze des Tropfens. Das Sphäroid Größe kann leicht durch Ändern der Zellkonzentration oder das Tropfenvolumen manipuliert werden, Tropfen Kulturen machen hanging besonders einfach zu steuern.

Frühe Untersuchungen über die 3D – Kultur von MSCs gezeigt radikalen Unterschiede in den Eigenschaften der Zellen in 3D im Vergleich zu ihren Pendants 2D ^{6, 8, 9.} Zur gleichen Zeit zeigten Berichte , dass die vorteilhaften Wirkungen von MSCs in vivo auf ihre Fähigkeit , durch Mikroumweltreize aktiviert zu werden , verlassen und in Reaktion darauf zu erzeugen , entzündungshemmende und immunmodulierende ¹¹ Faktoren. Interessanterweise viele dieser Faktoren wie Prostaglandin E2 (PGE2), Tumor-Nekrose-Faktor-stimulierte Gen 6 (TSG6) und Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) wurde in viel größeren Mengen von MSC Sphäroide als herkömmliche 2D MSCs ebnet den Weg für das produzierte Idee vonVerwendung von 3D – Kulturen , die Zellen ^{8, 12, 13} zu aktivieren. Außerdem Genaktivierung in 3D Kulturen erschienen Mechanismen zu rekapitulieren, zumindest teilweise der Zellaktivierung nach Injektion in ¹² Mäusen. Durch die in den Experimenten MSCs vor ihrer Verwendung zu aktivieren, Auswirkungen der Zellen verlängert werden könnte , und mehr im Vordergrund als die traditionelle MSC Wirkung in vivo oft verzögert und vorübergehend, und kann als "Hit and Run" beschrieben werden. In den letzten Jahren wichtige funktionelle Studien MSC Sphäroide verwenden , haben gezeigt , dass sie Entzündungsreaktionen zu unterdrücken und zu modulieren Immunität in vivo durch Effektorzellen , wie beispielsweise Makrophagen, dendritischen Zellen zu beeinflussen, Neutrophile und T – Zellen Sphäroide eine attraktive Form grundierte MSCs ² Herstellung ^{, 3.} Zusätzlich Herstellung von Anti-Krebs-Moleküle, wie interleukin-24 (IL-24) und Tumor – Nekrose – Faktor-verwandten Apoptose-induzierenden Liganden (TRAIL), werden in 3D – Kulturen von MSCs relativ erhöht MSCs zu Monoschicht ein Phänomen , das für die gezielte Krebstherapien ^{8, 10, 14} ausgenutzt werden könnte.

Da die traditionelle MSC Kultur nicht nur die Verwendung von Gewebekulturkunststoff erforderlich, sondern auch FBS, auf eine weitere Hürde zugänglich MSC Sphäroiden mehr machen für die klinische Anwendung zu überwinden hatte. Um diese Hürde bewältigen, wir die Bildung von Sphäroiden MSC unter bestimmten Bedingungen chemisch definierten XF kürzlich gezeigt und festgestellt , dass die resultierenden MSC Sphäroide wurden die gleichen entzündungshemmenden und anti-Krebs – Moleküle , wie die Sphäroide in Bedingungen mit ¹⁴ FBS erzeugt herzustellen aktiviert. Hier werden diese Erkenntnisse in mehreren ausführlichen Protokolle vorgestellt, die die Erzeugung von voraktivierten MSCs in 3D-Kulturen unter Verwendung von XF zeigenMedien. Außerdem werden Protokolle vorgestellt, die effektivsten Möglichkeiten, beschreiben die Aktivierungsstufen der MSCs in Bezug auf ihre entzündungshemmende, immunmodulierende und Anti-Krebs-Wirkung, zusammen mit einem praktischen Verfahren zur Beurteilung der intakten Sphäroiden in Mäuse zu liefern.