Produktion og administration af terapeutiske mesenchymstamceller / Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed i 3-D kulturer Under Xeno-frie betingelser

Mesenkymale stamceller / stromaceller (MSC'er) har vist stort potentiale for forskellige regenerativ medicin tilgange. MSC'er blev indledningsvis isoleret som et stromal bestanddel af knoglemarv, men er siden blevet opnået fra talrige andre voksne væv, herunder fedtvæv ^{1, 2, 3.} Interessant, den vigtigste isoleringsmetode omfavner den bemærkelsesværdige egenskab af MSC'er til at klæbe fast på vævskulturplast i nærværelse af føtalt bovint serum (FBS). Mens dette traditionelle isolation teknik tillader nem og hurtig ekspansion af MSC'er i todimensionale (2D) kultur, er det også meget kunstige og ignorerer betydningen af det native tredimensionale (3D) miljø, der fører til potentielle tab af vigtige cellulære karakteristika ^{4, 5 6.} Derfor studiet af MSC'er i 3D-kulturer, somer mere fysiologisk end traditionelle 2D kulturer, er opstået i søgning efter "tabte / formindsket" MSC egenskaber. Endvidere har stor interesse steget til identificere xeno-fri (XF) kemisk definerede betingelser for MSC kultur og aktivering, og således gøre cellerne mere medgørlige til kliniske anvendelser.

Mange undersøgelser er blevet offentliggjort viser 3D-kultur af MSC'er både biomaterialer og som sfæriske aggregater eller sphæroider. MSC'er i biomaterialer blev oprindeligt udviklet til væv tekniske tiltag til at erstatte beskadigede væv med celle-seedede stilladser, mens kugleformede kulturer af MSC'er ses som en måde at forstå MSC adfærd in vivo efter administration af cellerne for behandlinger i prækliniske eller kliniske forsøg ^{4, 5, 7.} Interessant, MSC danner sfæroider spontant, når tilslutning til vævskultur plast er ikke tilladt^{8, 9, 10.} Traditionelt blev celle aggregering lettes ved spinner kolbe metoder eller flydende overlay teknikker, metoder oprindeligt anvendt i cancer biologi i bestræbelserne på at forsøge at efterligne tumor mikromiljø. For nylig er yderligere fremgangsmåder dukket at demonstrere celleaggregering i dyrkningsskåle præ-overtrukket med specifikke kemikalier for at forhindre celle-til-plast vedhæftning ^{4, 5, 6.} En af de enkleste og mest økonomiske metoder til at generere MSC sfæroider er at kulturen dem i hængende dråber, en teknik, der ofte blev anvendt til fremstilling embryoide legemer fra embryonale stamceller. Med hængende dråbe dyrkningsteknik, er cellevedhæftning til vævsdyrkningsplastic forhindres ved at suspendere cellerne i en dråbe medium på undersiden af ​​en vævskulturskål låg og tillader tyngdekraften til at lette celle AGGREGation i spidsen af ​​dråben. Sfæroiden størrelse kan let manipuleres ved at ændre cellekoncentration eller drop volumen, hvilket gør hængende dråbe kulturer særlig let at kontrollere.

Tidlige undersøgelser af 3D kultur af MSC'er demonstrerede radikale forskelle i karakteristika for cellerne i 3D sammenlignet med deres 2D modstykker ^{6, 8, 9.} Samtidig, rapporter vist, at de gavnlige virkninger af MSC'er in vivo påberåbes deres evne til at blive aktiveret af mikro-miljømæssige påvirkninger, og som svar, til at producere anti-inflammatoriske og immunmodulerende faktorer ^11. Interessant, mange af disse faktorer, såsom prostaglandin E2 (PGE2), tumornekrosefaktor-stimuleret gen 6 (TSG6), og hepatocytvækstfaktor (HGF) blev produceret i meget større mængder af MSC sfæroider end traditionelle 2D MSC'er baner vejen for den ide omved hjælp af 3D-kulturer for at aktivere cellerne ^{8, 12, 13.} Desuden genaktivering i 3D-kulturer syntes at rekapitulere mekanismer, i det mindste delvist, af celleaktivering efter injektion i mus ^12. Ved at aktivere MSC'er forud for deres anvendelse i eksperimenter, kan virkningerne af cellerne blive forlænget og mere fremtrædende som den traditionelle MSC effekt in vivo ofte er forsinket og forbigående, og kan beskrives som "hit og køre". I løbet af de sidste mange år har vigtige funktionelle undersøgelser under anvendelse af MSC sfæroider vist, at de kan undertrykke inflammatoriske responser og modulerer immunitet in vivo ved at påvirke effektorceller såsom makrofager, dendritiske celler, neutrofiler, og T-celler gør sfæroider en attraktiv form for primede MSC'er ^{2 3.} Desuden produktion af anti-cancer molekyler, såsom interleukin-24 (IL-24) og tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL), forhøjes i 3D kulturer af MSC'er i forhold til monolag MSC'er, et fænomen, der kan udnyttes til målrettede behandlinger mod kræft ^{8, 10, 14.}

Som den traditionelle MSC kultur ikke blot krævede anvendelse af vævskultur plast, men også FBS, til en anden hurdle gøre MSC sfæroider mere medgørlige til klinisk anvendelse skulle overvindes. For at løse dette hurdle, vi for nylig viste dannelse af MSC spheroids under specifikke kemisk definerede XF forhold og konstateret, at de resulterende MSC sfæroiderne blev aktiveret til at producere de samme anti-inflammatoriske og anti-cancer molekyler som sfæroiderne genereret i forhold med FBS ^14. Her er disse resultater præsenteres i flere detaljerede protokoller, der viser dannelsen af ​​præ-aktiverede MSC'er i 3D kulturer bruger XFmedier. Desuden er protokoller præsenteret som beskriver effektive måder til at vurdere aktivering niveauer af MSC'erne i forhold til deres anti-inflammatoriske, immunmodulerende og anti-cancer effekt, sammen med en praktisk metode til at levere de intakte sfæroider i mus.