Guiada por imagen, fabricación basada en láser de Redes de microfluidos derivados-vascular
Summary
This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced “on-a-chip” devices.
Abstract
Este protocolo detallado describe la aplicación de guiado por imágenes, la degradación del hidrogel basado en láser para la fabricación de redes de microfluidos vasculares derivados incrustados en hidrogeles PEGDA. Aquí, se describe la creación de máscaras virtuales que permitan el control de láser guiada por imagen; la fotopolimerización de un hidrogel PEGDA micromolded, adecuadas para la fabricación de la red de microfluidos y el flujo de cabeza impulsada por la presión; la configuración y el uso de un microscopio confocal de barrido láser disponible en el mercado junto con un femtosegundo pulsada Ti: S láser para inducir la degradación de hidrogel; y la formación de imágenes de las redes de microfluidos fabricados utilizando especies fluorescentes y microscopía confocal. Gran parte del protocolo se centra en la configuración y ejecución del software de microscopio y microscopio macro, ya que estos son pasos cruciales en el uso de un microscopio comercial para fines de fabricación de microfluidos que contienen una serie de complejidades. El componente guiada por imagen de este technique permite la implementación de las pilas de imágenes en 3D o modelos 3D generados por los usuarios, con lo que permite un diseño creativo y de microfluidos para la fabricación de sistemas de microfluidos complejas de prácticamente cualquier configuración. Con un impacto esperado en la ingeniería de tejidos, los métodos descritos en este protocolo podrían ayudar en la fabricación de construcciones avanzadas microtejidos biomiméticos para dispositivos zaciones y humanos-en-un-chip. Al imitar la compleja arquitectura, tortuosidad, el tamaño y la densidad de la vasculatura in vivo, los procesos esenciales de transporte biológicos pueden ser replicados en estas construcciones, dando lugar a más precisa de modelado in vitro de la farmacocinética de las drogas y las enfermedades.
Introduction
El sistema vascular, que consiste tanto linfático y vasos cardiovasculares, las formas de las redes de alta densidad que son esenciales para el transporte de nutrientes y oxígeno y para la eliminación de desechos metabólicos. En consecuencia, las células que residen en los tejidos vascularizados son nunca más de 50 a 100 micras de distancia de un recipiente 1. La capacidad para reproducir la arquitectura vascular in vivo in vitro es crítica para modelar con precisión los procesos de transporte en vivo usando construcciones de ingeniería. Con una reciente unidad para desarrollar dispositivos de órgano-on-a-chip 2 para drogas de alto rendimiento de detección 3,4 y 5,6 modelización de enfermedades, métodos para crear redes de microfluidos que recapitular el transporte in vivo -como en hidrogeles sintéticos o naturales están dibujo un interés significativo. Para mejorar la biomimética de microtejidos utilizados en estos dispositivos, hemos desarrollado un método de degradación de hidrogel guiada por imagen, basado en láser que utiliza tres dimensional pilas de imágenes (3D) de la vasculatura nativa como plantillas para generar redes de microfluidos vasculares derivados incrustados en PEGDA hidrogeles 7. Este protocolo describe el uso de un microscopio confocal de escaneo láser comercialmente disponible equipado con un láser de impulsos de femtosegundo para fabricar, redes de microfluidos biomiméticos vasculares derivados de hidrogeles PEGDA a través de, la degradación basada en láser guiada por imagen.
Los enfoques actuales para fluidificar hidrogeles incluyen la inducción de origen vascular o 8-10 10-12 técnicas de células endoteliales de autoensamblaje y microfabricación angiogénicos para crear canales pre-definidos para la endotelización 13-16. Si bien las redes autoensambladas recapitulan la densidad y la arquitectura compleja de microvasculatura, a menudo son más permeables que las redes in vivo 11,17,18, que puede ser problemático en el transporte de modelado para aplicaciones de cribado de fármacos. redes de auto-ensambladas consisten en physiologcamente relevante, los vasos capilares de tamaño, pero pueden ser difíciles de integrar en el flujo de fluido a granel debido a las limitaciones en la generación de buques de mayor tamaño de las arteriolas. Como no hay un control directo sobre el conjunto de estas redes, la arquitectura final puede variar de una muestra a otra, por lo que es difícil de producir repetidamente redes con las mismas propiedades de flujo y de transporte de fluidos.
Para generar 3D, las redes de microfluidos de hidrogel incrustado con geometría repetible y la arquitectura bien definida, un número de técnicas de microfabricación se han desarrollado, incluyendo el montaje modular 13, la impresión 3D de materiales de sacrificio 16, de montaje y escritura directa 14, y la impresión de omnidireccional 15. La aplicación de estos métodos, la arquitectura de microfluidos, y propiedades de flujo y de transporte, por tanto, de fluidos, se pueden fabricar varias veces a través de muchas construcciones. Una limitación importante de estos enfoques, sin embargo, es la incapacidad para crear microfluidic redes con características capilares de tamaño, de 4 a 10 micras 19. La mayoría de las técnicas de microfabricación a menudo se limitan a las características de 150 a 650 micras de diámetro 13,16. Algunas de las técnicas existentes son capaces de generar redes jerárquicas con canales a través de un rango de diámetro de ancho, 10 a 300 micras para el montaje y escritura directa 14, y 18 a 600 micras para la impresión omnidireccional 15, pero están limitados en su capacidad de generar redes densas o para producir múltiples redes de microfluidos en estrecha proximidad dentro de un mismo constructo 7.
Para superar algunas de estas limitaciones, se desarrolló una, técnica de degradación de hidrogel basado en láser guiada por imagen que permite la fabricación repetible de biomimético, redes de microfluidos jerárquicas que recapitular la arquitectura de la microvasculatura en vivo. Para ello, un 790 nm, 140 femtosegundos (fs) de láser pulsado que funciona a 80 MHz es la trama i-escaneadan deseada ubicaciones 3D dentro de un hidrogel, como se define por las imágenes de la vasculatura in vivo. Especulamos que el proceso de degradación opera a través de la descomposición inducida por láser óptico de agua, la formación de plasma resultante, la posterior expansión termoelástica rápido de agua, y la degradación local de la hidrogel como el agua se expande 20. Este mecanismo varía ligeramente de degradación basado en láser de hidrogeles a base de proteínas 21-24. A diferencia de PEGDA, que tiene una sección transversal multifotónica bajo, las proteínas tienen a menudo una sección transversal de multifotónica grande y por lo tanto se degradan a través de una multifotónica absorción inducida por la rotura química 23. Para generar redes de microfluidos guiados por imagen, el obturador de láser se controla por las máscaras virtuales imagen derivada, que consisten en un mosaico de regiones de interés 9 que definen la arquitectura de microfluidos. Con este enfoque, hemos demostrado la capacidad de fabricar 3D microfluidos biomimético vasculares derivadasredes ic, que recapitulan la arquitectura densa y tortuosa de la vasculatura in vivo, a fin de controlar localmente la porosidad de los hidrogeles mediante la alteración de la cantidad de energía suministrada durante la degradación. También hemos sido capaces de generar dos redes independientes de microfluidos que se entrelazan en las proximidades (15 micras), pero nunca se conectan directamente 7. También hemos demostrado la capacidad de endothelialize microcanales láser degradada a través funcionalización degradación post con la secuencia del péptido ligando de integrina, arginina-glicina-ácido aspártico-serina (MFG), para promover la adhesión de las células endoteliales y la formación del lumen 7.
Con este protocolo, se hace posible la generación de redes complejas de microfluidos en hidrogeles PEGDA vía, la degradación basada en láser guiada por imagen utilizando un microscopio disponible comercialmente accesibles en muchos campus universitarios. A medida que el proceso de degradación se guía por las máscaras digitales, virtuales, esta fabricatécnica de la es susceptible para el diseño creativo de redes de microfluidos, permitiendo su uso en una amplia variedad de aplicaciones. Anticipamos que el método descrito aquí será más ventajosa en el diseño de dispositivos zaciones y humanos-on-a-chip biomiméticos capaces de replicar los procesos de transporte biológicos importantes en el transporte de drogas de modelado 2. Esta técnica de fabricación también puede ser de interés para la generación de modelos de enfermedades in vitro, incluyendo la metástasis del cáncer 5,6 y modelos de la barrera hematoencefálica 25. Como la degradación de hidrogel basado en láser anteriormente se ha utilizado para crear pistas para la guía de excrecencia neuronal 21-23, la extensión guiada por imagen de esta técnica podría resultar útil en estrategias avanzadas de ingeniería de tejidos para colocar las células en disposiciones espaciales en 3D definidos por el usuario.
Protocol
Representative Results
Discussion
Crítico en anulando las funciones estándar del software de microscopio para permitir el uso de máscaras virtuales para, la degradación basada en láser guiada por imagen, la macro microscopio debe ser configurado y manipulado con cuidado. ¿Cómo las interfaces de software microscopio con la macro microscopio a veces puede ser contrario a la intuición, y mucho esfuerzo se ha invertido en la determinación de la configuración óptima en ambos programas para desarrollar este método. Se recomienda un conocimiento general de escaneo láser confocal básica uso del microscopio, especialmente con la "Etapa" y "ventanas" Focus para la búsqueda y el posicionamiento del hidrogel en las x, y, z y dimensiones, antes de intentar la degradación basada en el láser correctamente. Además, la fabricación de un canal de entrada es crítica para el protocolo; especies fluorescentes suspendidos deben ser capaces de entrar en los sistemas de microfluidos para obtener imágenes de éxito y la caracterización de la red. Es importante señalar que este protocolo se aplica a una específica lásermicroscopio confocal de barrido configurado con un láser pulsado de femtosegundo específica, con versiones específicas del software de microscopio y la macro microscopio (ver detalles en la Lista de materiales específicos / Equipo). Hemos descubierto que las nuevas versiones de la macro microscopio carecen de la funcionalidad necesaria de control y necesaria para el control de láser guiada por imagen. Mientras que otras plataformas de microscopio y las fuentes de láser de impulsos se pueden utilizar, este protocolo se aplica específicamente a este sistema y necesitará modificación de acuerdo con la plataforma, fuente de láser, y el software implementado. Los principios que subyacen a lo largo de este protocolo se siguen aplicando, sin embargo.
Una modificación potencial de este protocolo consiste en cambiar la composición de hidrogel. Aquí, se utilizó 5% en peso, 3.4 hidrogeles kDa PEGDA, pero la degradación basada en láser (para fines aparte de la generación de la red de microfluidos) ha sido implementado para degradar ambos hidrogeles sintéticos y naturales, incluyendo PEGilado fibrina21,22 fibrinógeno, proteína de seda hidrogeles de 23, 24 y colágeno. El ajuste de la potencia del láser, velocidad de exploración, el espaciamiento entre Z-rebanadas, y el número de repeticiones ayudará a determinar los parámetros óptimos para fabricar redes de microfluidos en otras formulaciones de hidrogel.
Una limitación actual de la técnica es el volumen global de hidrogel que puede ser degradado en una cantidad factible de tiempo. Para crear huecos abiertos o características de microfluidos dentro del hidrogel, el láser el tiempo de permanencia debe ser igual o superior a 8,96 mu s / píxel (o una velocidad de barrido de láser de 0,021 m / microsiemens) cuando se utiliza una fluencia del láser de 37,7 nj / m 2. Con estos ajustes, se tarda 1,4 h para degradar los vasos dentro de un volumen 0.014 mm 3 (como se ve en la Figura 1). El uso de un láser de tiempo de permanencia de 4,48 mu s / píxel o por debajo, la energía suministrada no es suficiente para la completa degradación de la formulación de hidrogel utilizado aquí. La implementación de un hidrogel diferentecomposición podría superar esta limitación. El uso de geles fotolábiles que contienen componentes sensibles a la luz 34-36 o hidrogeles que tienen gran multifotónica secciones transversales 21-24 son buenas opciones que permitan el uso de menos energía y daría lugar a una degradación más rápida. Con respecto a las limitaciones dimensionales, las características se han fabricado hasta 1,5 mm de profundidad en el hidrogel 7. El alcanzable profundidad es una función de la distancia de trabajo del objetivo y se puede aumentar usando objetivos distancia de trabajo ultra-largas optimizados para formación de imágenes in vivo. El canal más pequeño medido 7 creado usando un 20X (NA1.0) objetivo de inmersión en agua tenía una anchura de 3,3 m y la profundidad de 8,9 m, la cual está a la par con el tamaño de los canales más pequeños generados en la Figura 1. Mientras que otros laboratorios han utilizado objetivos inferiores NA 21,23,24, anticipamos que las redes de microfluidos con características más pequeñas se pueden generar utilizando altaer objetivos de NA, a expensas de una distancia de trabajo reducida. En última instancia, sin embargo, la resolución de la técnica es una función de la función de dispersión de punto del haz de láser enfocado, las propiedades de exploración láser, la cantidad de energía suministrada por el láser, y las propiedades de absorción de láser del material que está siendo degradado.
Además, las propiedades de láser (velocidad, fluencia, el espaciamiento entre las máscaras virtuales, y el número de repeticiones) deben optimizarse basándose en las propiedades de hidrogel (densidad de reticulación, / peso macrómero monómero molecular, por ciento en peso, y el tipo de hidrogel: proteína de base sintética vs. ), ya que estos inherentemente alterar las interacciones con el láser y por lo tanto la resolución final del proceso. A medida que la energía entregada también se ve influida por el objetivo utilizado, se requiere una optimización adicional cuando se cambia entre objetivos. Con respecto a los costos involucrados, se requiere el acceso a un microscopio con un láser de impulsos, y mientras muchos objec diferentetantes se pueden utilizar, los que tienen un alto NA y larga distancia de trabajo (para formación de imágenes in vivo) puede ser costoso.
Por encima y más allá del protocolo detallado aquí, las redes de microfluidos generados utilizando esta técnica también se pueden funcionalizar con péptidos de células adhesivo post-canal de fabricación para inducir la adhesión de células endoteliales y la formación del lumen 7. Además, la incorporación de secuencias de péptidos de células degradable en el material a granel 9 antes de canalizar la degradación podría permitir para el estudio de la migración de células en y a través del hidrogel. Para la fluidización continua de la red de microfluidos en el hidrogel, los hidrogeles se pueden fotopolimerizar en dispositivos fluídicos o carcasas más grandes, como se demuestra en las figuras 2 y 3 7.
La generación de redes vasculares a través de auto-ensamblaje de origen vascular o angiogénico 8-12 proporciona un enfoque sencillo para inducir VAscularization lo largo de un volumen relativamente grande de hidrogel. Si bien este enfoque resulta en redes de fluidos perfusable, es difícil de controlar directamente el tamaño, tortuosidad, la densidad, y la arquitectura general de la red. Debido a esta limitación, el perfil de flujo y velocidades de cizallamiento en la vasculatura pueden diferir entre los experimentos. Alternativamente, las técnicas de microfabricación 13-16 permiten el control directo sobre la arquitectura de red, pero a menudo están limitados por su incapacidad para generar canales pequeñas, capilares de tamaño o la fabricación de redes densas que imitan la arquitectura vascular in vivo. Mientras que la técnica de degradación de hidrogel basado en láser descrito aquí ha sido recientemente reutilizados para la generación de microfluidos, simultáneamente supera tanto el control de la arquitectura y limitaciones basadas en el tamaño de los métodos de microfabricación existentes al permitir la creación de 3D redes de microfluidos biomiméticos que recapitular la densidad, tortuosidad, rango de tamaño, y Architectur generale de la vasculatura in vivo. Además, múltiples redes de fluidos pueden ser generados en un solo hidrogel, lo que permite el estudio de transporte inter-red 7. Para aplicaciones de ingeniería de tejidos que se esfuerzan por reproducir más de cerca es los procesos de transporte in vivo in vitro, las redes de microfluidos de hidrogel incrustado altamente resueltos descritos aquí son muy adecuados. Anticipamos que este protocolo será útil en el desarrollo de construcciones de tejido que más de reproducir fielmente el transporte in vivo para su uso como dispositivos de detección de drogas y es modelos in vitro de enfermedades.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Jeff Caplan and Mr. Michael Moore at the Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center for their support with confocal microscopy. Access to microscopy equipment was supported by the National Institutes of Health (NIH) shared instrumentation grants (S10 RR0272773 and S10 OD016361) and the State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). This research was supported by grants from the Institutional Development Award (IDeA) from the NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), the American Cancer Society (14-251-07-IRG), the University of Delaware Research Foundation (14A00778), the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013), and the NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).
Materials
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC D=0.17 M27 75mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
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