혈관 유래 미세 유체 네트워크의 이미지 유도, 레이저 기반의 제조
Summary
This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced “on-a-chip” devices.
Abstract
이 상세한 프로토콜은 PEGDA의 하이드로 겔에 포함 된 혈관 유래 미세 유체 네트워크의 제작을위한 영상 유도, 레이저 기반 하이드로 겔 저하의 구현을 설명합니다. 여기서는 영상 유도 레이저 제어를 허용 가상 마스크의 생성을 설명; 미세 유체 네트워크 제조 및 압력 헤드 구동 흐름에 적합한 micromolded PEGDA 하이드로 겔의 광중합; 펨토초 펄스의 Ti와 결합 시판의 레이저 스캐닝 공 초점 현미경의 설치 및 사용 : 하이드로 겔 저하를 유도 S 레이저; 그리고 제작 된 미세 유체 네트워크 촬상 형광 종 및 공 촛점 현미경을 사용. 이러한 복잡성의 번호를 포함하는 미세 가공을 위해 상용 현미경 사용에 중요한 단계는 같은 프로토콜의 대부분은 현미경 소프트웨어 및 현미경 매크로의 적절한 설정 및 구현에 집중된다. 이 techniqu의 영상 유도 구성 요소E함으로써 소재 미세 디자인 거의 모든 구성이 복잡한 마이크로 유체 시스템의 제작을 가능 3D 이미지 스택 또는 사용자가 생성 한 3D 모델의 구현을 허용한다. 조직 공학에 예상되는 영향으로,이 프로토콜에 설명 된 방법은 organ- 인간 – 온 – 어 – 칩 장치에 대한 고급 생체 모방 microtissue 구조의 제작에 도움을 수 있습니다. 생체 내 혈관의 복잡한 구조, 비틀림, 크기 및 밀도를 흉내 필수적 생물학적 전송 과정은 약물 약동학과 질병의 정확한 시험 관내 모델 선도 이러한 구조로 복제 될 수있다.
Introduction
림프 및 cardiovasculature 모두 구성된 혈관 시스템, 형태 영양분과 산소의 수송과 대사 폐기물의 제거에 필수적인 고밀도 네트워크를. 따라서, 혈관 조직에 존재하는 세포보다 50 ~ 100 μm의 거리에 용기 (1)에서 결코 없습니다. 시험관 내에서 생체 내 혈관 구조를 재생하는 기능을 정확하게 설계 구조를 사용하여 생체 내에서 전송 프로세스를 모델링하는 것이 중요하다. 3,4 질병 모델링 5,6 선별 높은 처리량 약물 기관 – 온 – 어 – 칩 장치 (2)를 개발하기 위해 최근 드라이브, 방법이 그리는 합성 또는 천연 하이드로 겔의 생체 -like 전송을 요점을 되풀이 미세 유체 네트워크를 만들 수 있습니다 상당한 관심. 이들 장치에 사용 microtissues의 생체 모방을 강화하기 위해 세 dimensiona를 이용하는 영상 유도 레이저 기반 겔 분해 방법을 개발템플릿으로 기본 혈관의 리터 (3D) 이미지 스택은 7 하이드로 겔 PEGDA에 포함 된 혈관 유래 미세 유체 네트워크를 생성합니다. 이 프로토콜은 이미지 유도 레이저 기반 열화 통해 PEGDA 하이드로 겔 혈관 유래, 생체 모방 미세 유체 네트워크를 제작 펨토초 펄스 레이저를 구비 한 시판되는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경의 사용을 설명합니다.
하이드로 겔을 유동화하는 현재의 접근 방식에 내피 13-16를 위해 미리 정의 된 채널을 생성하는 혈관 신생 8-10 또는 혈관 신생 10-12 내피 세포의 자기 조립과 미세 기술의 유도를 포함한다. 자기 조립 네트워크가 밀도와 미세 혈관의 복잡한 구조를 요점을 되풀이하는 동안, 그들은 종종 약물 검사 애플리케이션을위한 모델링 전송에 문제가 될 수있다 생체 네트워크 11,17,18,보다 더 투과성이다. 자기 조립 네트워크는 physiolog 구성ically 관련, 모세관 크기의 용기,하지만 인해 큰 세동맥 크기의 혈관 생성의 제한 대량 유체 흐름과 통합하기가 어려울 수 있습니다. 이러한 네트워크의 조립을 통해 직접 제어가 없으므로, 최종 구조는 반복해서 같은 유체 유동 및 전송 특성을 갖는 네트워크를 생성하는 것이 곤란하게 샘플들에서 변할 수있다.
3D, 반복 구조 및 잘 정의 된 구조를 가진 하이드로 겔 포함 미세 유체 네트워크를 생성하기 위하여, 마이크로 제조 기술의 개수는 모듈 어셈블리 (13), 희생 물질 (16), 직접 기록 조립체 (14) 및 전 방향성 인쇄 (15)의 3D 인쇄를 포함하여 개발되었다. 이들 방법, 미세 구조, 따라서 유체 유동 및 전송 특성을 적용하여 반복하여 다수의 구조물에 걸쳐 제조 될 수있다. 이러한 방식의 가장 큰 한계는 있지만, 초 미세 합성 섬유를 만들 수 없다는 것이다모세관 크기의 기능을 luidic 네트워크, 4 ~ 10 μm의 19. 대부분의 미세 가공 기술은 종종 직경 13, 16에서 150에서 650 μm의에 이르기까지 다양한 기능으로 제한됩니다. 일부 기존의 기술은 직접 기록 조립체 (14)에 대해 10 내지 300 ㎛, 다양한 직경의 범위에 걸쳐 채널 계층 네트워크를 생성 할 수 있으며, 전 방향성 인쇄 15 18-600 μm의,하지만 이들은 밀집 네트워크 또는 생성 할 수있는 능력에 제한이 단일 구조 (7) 내에서 가까운 거리에 여러 개의 미세 유체 네트워크를 생성한다.
이러한 한계 중 일부를 극복하기 위해, 우리는 생체 모방의 반복 가공, 생체 내 미세 혈관의 구조를 계층 적 요점을 되풀이 미세 유체 네트워크를 허용하는 영상 유도 레이저 기반 겔 분해 기술을 개발 하였다. , 그래서 790 nm의, 140 펨토초 (FS) 80 MHz에서 동작하는 펄스 레이저를 수행하려면 래스터 스캔 전입니다생체 맥관계의 이미지에 의해 정의 된 N, 하이드로 겔 내에서 3 차원 위치를 원하는. 우리는 물 (20)을 팽창과 같이 분해 처리 물의 레이저 광 유도 분해, 생성 된 플라즈마의 형성 물 후속 급속 열 탄성 팽창 및 하이드로 겔의 지방 분해를 통해 동작하는 것을 추측. 이 메커니즘은 단백질 기반의 하이드로 겔 21-24의 레이저 기반 저하와 약간 다릅니다. 낮은 다 광자 단면을 갖는 PEGDA 달리, 단백질은 종종 많은 광자 단면을 가지며, 따라서 광자 흡수 유도 화학 파손 (23)를 통해 저하한다. 영상 유도 미세 유체 네트워크를 생성하기 위해, 레이저 셔터는 미세 구조를 정의하는 관심 영역 (9)의 모자이크 이미지로 구성 유래 가상 마스크에 의해 제어된다. 이 방법을 사용하여, 3 차원 혈관 유래 생체 모방 미세 유체를 제조 할 수있는 능력을 입증하기 위해, 생체 내 혈관의 밀도 및 아키텍처 비틀린 요점을 되풀이 IC 네트워크는 로컬 분해시 발생하는 에너지의 양을 변경하여 하이드로 겔의 다공성을 제어한다. 우리는 또한 가까운 거리 (15 μm의)에 얽혀 있지만 직접 칠을 연결하지 마십시오 두 개의 독립적 인 미세 유체 네트워크를 생성 할 수 있었다. 우리는 또한 아르기닌 – 글리신 – 아스파르트 산 – 세린 (RGDS가), 내피 세포 부착 및 루멘 형성 7을 홍보하기 위해 인테그린 결찰 펩타이드 서열과 포스트 분해 작용을 통해 레이저 성능이 저하 된 마이크로 채널을 endothelialize 할 수있는 능력을 증명하고있다.
이 프로토콜로, PEGDA 하이드로 겔 복잡한 미세 유체 네트워크의 생성은 많은 대학 캠퍼스에 액세스 할 수있는 상업적으로 이용 가능한 현미경을 사용하여 영상 유도, 레이저 기반 분해를 통해 가능합니다. 분해 공정은 디지털 가상 마스크에 의해 안내되고,이 FABRICA기 기술은 다양한 애플리케이션에서의 사용을 허용하는, 미세 유체 네트워크 소재 디자인 의무이다. 우리는 여기에 기재된 방법은 모델링 약물 수송이 중요한 생물학적 전송 프로세스를 복제 할 수있는 생체 모방 organ- 인간 – 온 – 칩 디바이스 설계에 가장 유리할 것으로 예상된다. 이 제조 기술은 암전 5,6- 및 혈액 – 뇌 장벽 모델 (25)을 포함한 체외 질병 모델의 생성에 대한 관심이있을 수있다. 레이저 기반 겔 열화는 이전 신경 생장 21-23의 안내 트랙을 만드는 데 사용 된 바와 같이,이 기법은 영상 유도 확장은 사용자 정의 된 3 차원 공간 배치의 셀 위치를 고급 조직 공학 전략에서 유용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
영상 유도 레이저 기반 분해 가상 마스크를 사용할 수 있도록 현미경 소프트웨어의 표준 기능을 무시 긴급 현미경 매크로 설정 조심스럽게 조작한다. 방법 현미경 매크로 현미경 소프트웨어 인터페이스는 종종 직관에 반하는 일 수 있고, 많은 노력이 방법을 개발하기 위해 두 프로그램의 최적 설정을 결정하는데 투자했다. 기본 레이저 스캐닝 공 초점 레이저 주사 현미경 사용에 대한 일반적인 이해를 특히 "단계"를 찾아 정확하게 레이저 기반 분해 전에, x, y 및 z 차원 히드로 겔을 위치시키는 "포커스"윈도우에 추천된다. 또한, 입구 채널의 제조 프로토콜에 중요하다; 현탁 형광 종 성공적인 촬상 네트워크 특성화 미세 유체 시스템을 입력 할 수 있어야한다. 이 프로토콜은 특정 적용된다는 점에 유의해야합니다 레이저 가공스캐닝 공 초점 현미경은 특정 현미경 소프트웨어의 버전 및 현미경 매크로 (특정 자재 / 장비의 목록 정보를 참조)를 실행, 특정 펨토초 펄스 레이저로 구성. 우리는 현미경 매크로의 최신 버전은 영상 유도 레이저 제어에 필요한 필요한 제어 기능이없는 것을 발견했다. 다른 현미경 플랫폼 및 펄스 레이저 소스를 사용할 수 있지만,이 프로토콜이 시스템에 특별히 적용 및 구현 플랫폼, 레이저 소스 및 소프트웨어에 따라 수정이 필요합니다. 이 프로토콜을 통해 기본 원칙은 여전히 있지만, 적용됩니다.
이 프로토콜에 대한 잠재적 인 수정은 하이드로 겔 조성물을 변경하는 것을 포함한다. PEG 화 피브린 포함한 합성 및 천연 하이드로 겔 모두 저하 구현되었습니다 여기서는 5 중량 %, 3.4 kDa의 PEGDA 하이드로 겔을 이용하지만, (미세 유체 네트워크 생성 제외 상업적) 레이저 기반 저하21,22 ogen 실크 단백질은 23 하이드로 겔, 콜라겐 24. 레이저 파워, 주사 속도, Z-조각 사이의 간격 및 반복 횟수를 조절 다른 하이드로 겔 제형의 미세 유체 네트워크를 제조하는 최적의 파라미터를 결정하는 데 도움된다.
기술 중 하나는 전류 제한 시간의 가능한 양으로 분해 될 수있는 하이드로 겔의 전체 부피이다. 열린 공극 또는 하이드로 겔 내에서 미세 유체 기능을 만들려면 레이저는 37.7 뉴저지 / μm의 2의 레이저 플루 언스를 사용하는 경우 시간 (/ μs의 또는 0.021 ㎛의 레이저 스캔 속도) 또는 8.96 μS / 픽셀 이상이어야 거. (그림 1) 이러한 설정으로, 그것은 0.014 mm 3 볼륨 내에서 혈관을 저하 1.4 시간이 걸립니다. 아래 4.48 μS / 또는 픽셀의 레이저 체류 시간을 이용하여 전달 된 에너지는 여기에서 사용 된 하이드로 겔 제형의 완전 분해 충분하지 않다. 다른 하이드로 겔 구현조성물은 이러한 한계를 극복 할 수있다. 감광 요소 또는 34-36 큰 광자 단면 21-24을 포함 광 불안정성 히드로 겔의 사용은 더 적은 에너지의 사용을 가능하게 할 빠르게 저하 될 것이 좋은 선택이다. 치수의 제한과 관련하여, 특징은 하이드로 겔 (7)의 깊이는 1.5 mm까지 제조되어왔다. 깊이 달성 대물의 작동 거리의 함수이고, 생체 내 영상에 최적화 울트라 긴 작동 거리를 사용하여 목표를 증가시킬 수있다. 최소 측정 된 채널 7은 20 배 (NA1.0) 침수 목적은 그림 1에서 생성 된 작은 채널의 크기와 파에 8.9 ㎛의 3.3 μm의 폭과 깊이를 가지고 사용하여 만들었습니다. 다른 실험실 낮은 NA 목표 21,23,24를 사용하고 있지만, 우리는 작은 기능과 미세 유체 네트워크는 높은 사용하여 생성 될 수 있다는 것을 예상감소 된 작동 거리를 희생 ER NA 목적. 궁극적으로, 그러나, 기술의 해상도가 집중된 레이저 빔의 점 확산 함수의 함수이고, 상기 스캔 특성, 레이저에 의해 전달되는 에너지의 양, 그리고 재료의 레이저 흡수 특성이 저하된다.
합성 대 단백질 계 : 또한, 레이저 특성 (속도, 플루 언스는 가상 마스크 및 반복 횟수 사이의 간격) (가교 밀도 로머 / 단량체 분자량 중량 %, 및 하이드로 겔의 형태 겔 특성에 기초하여 최적화되어야 )이 본질적 레이저 따라서 공정의 궁극적 인 분해능과의 상호 작용을 변경하는 바와 같이. 전달 된 에너지는 또한 사용 목적에 의해 좌우되기 때문에 목표를 전환 할 때, 추가의 최적화가 필요하다. 관련된 비용과 관련하여, 펄스 레이저 현미경에 대한 액세스가 필요하고, 많은 다른 objec 반면tives 높은 NA와 (생체 내 이미징) 긴 작동 거리들은 고가 일 수 사용될 수있다.
상기 및 여기 설명 된 프로토콜을 넘어,이 기술을 사용하여 생성 된 미세 유체 네트워크는 또한 내피 세포 부착 및 루멘 형성 (7)을 유도하는 세포 접착 성 펩티드 후 채널을 제조하여 관능 화 될 수있다. 또한, 저하를 채널로 대량 재료 (9) 이전에 세포 분해 펩타이드 서열의 혼입에와 하이드로 겔을 통해 세포 이동의 연구를 위해 허용 할 수 있습니다. 도 2 및도 3 내지 7에서 설명한 바와 같이, 하이드로 겔 내의 미세 망의 연속 유동 들어, 하이드로 겔이 큰 유체 장치 또는 하우징에 광중합 할 수있다.
혈관 신생 또는 혈관 신생 조립식 8-12 통한 혈관 네트워크의 VA 생성을 유도하는 간단한 방법을 제공한다상대적으로 큰 겔 부피에 걸쳐 scularization. 이 방법은 관류 유체 네트워크에서 발생하지만, 직접 크기, 비틀림, 밀도, 및 전반적인 네트워크 아키텍처를 제어하는 것은 곤란하다. 이러한 제한으로 인해 혈관의 흐름 프로필 및 전단 속도는 실험 사이에 다를 수 있습니다. 또한, 미세 기술 13-16 네트워크 아키텍처를 직접 제어를 허용하지만 종종 작은 모세관 크기의 채널 또는 생체 내 혈관 구조에 모방 조밀 한 네트워크의 제조를 생성하기 위해 자신의 무능력에 의해 제한됩니다. 여기에 설명 된 레이저 기반 겔 분해 기술이 새롭게 미세 세대 용도 변경되었지만, 동시에 구조적 제어 밀도 비틀림 요점을 되풀이 3D 생체 모방 미세 유체 네트워크의 생성을 가능하게함으로써, 기존 미세 가공 방법의 크기 기반 제한을 모두 극복 크기 범위 및 전반적인 건축 설계생체 내 혈관의 전자. 또한, 다중 유체 네트워크 간 네트워크 전송 (7)의 조사를 허용 한 겔에서 생성 될 수있다. 더 밀접하게 체외에서 생체 내 운송 과정에서 복제하기 위해 노력하고 조직 공학 응용 프로그램의 경우, 여기에 설명 된 고도의 해결 하이드로 겔 포함 된 미세 유체 네트워크는 적합하다. 우리는이 프로토콜은 조직 구조를 개발에 도움이 될 것으로 예상하는 약물 검사 장치와 같은 체외 질병 모델에서 사용하기에 더 정확하게 모방 생체 내 전송.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Jeff Caplan and Mr. Michael Moore at the Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center for their support with confocal microscopy. Access to microscopy equipment was supported by the National Institutes of Health (NIH) shared instrumentation grants (S10 RR0272773 and S10 OD016361) and the State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). This research was supported by grants from the Institutional Development Award (IDeA) from the NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), the American Cancer Society (14-251-07-IRG), the University of Delaware Research Foundation (14A00778), the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013), and the NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).
Materials
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC D=0.17 M27 75mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
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