성인 및 노인 인간의 골격 근육에서 근육 조직 전구체 세포 / 차 근육 아세포의 준비 및 문화

여기에 설명 된 인체 조직을 포함하는 모든 실험은 리버풀의 대학, 대학 병원 도날드 병원과 사우스 웨스트 웨일즈 연구 윤리위원회의 사전 승인되지 않았다 (승인 번호 : 13 / WA / 0374) 및 실험은 좋은 연습 지침에 따라 수행 하였다. 윤리는이 연구를 위해 후원으로 리버풀의 대학은 행동했다. 모든 기부자는이 연구의 등록에 대한 동의서를 부여했다. 근육이 사람들로부터 분리 하였다 (BMI <25) : 성인 : 30 ± 2.8 세 세 : 69 ± 5 세. 문화 1. 준비 문화의 코팅 라미닌과 표면 1X DPBS에서 라미닌의 10 μg의 / ㎖ (둘 베코 인산염 완충 생리 식염수)의 작업 솔루션을 준비합니다. 완전 세포 (표 1) 도금 될 예정에있는 표면을 덮도록 라미닌 용액 최소량 피펫. t을 품어세포 도금 전에 가습 37 ° C에서 그 배양 접시에 적어도 30 분, 5 % CO 2 인큐베이터. 와류의 사용을 피하고, 신중 라미닌 핸들. DPBS에 희석하여 10 μg의 / ㎖의 라미닌 작동 용액은 39 ° C에서 저장 될 수 있고, 여러 번 재 – 사용된다. 6 웰 플레이트에서 60mm (20cm 2) 페트리 접시 또는 2 우물을 사용 (2 × 10cm 2) ~ (18) 당 – 골격 근육의 19 mg의 세포 (총 5.50 × 10 4 셀) 판입니다. 기능 연구에 세포를 도금 할 때 항상 휴대 계산을 수행합니다. 참고 : 샘플은 원래 여성 환자 (30 ± 2.8 세, 나이 : 69 ± 5 세, BMI <25 성인)의 발 수술 (신근 심지 브레비스, 전 경골근 또는 외전 halluces 근육)에서 얻었다. 효소 용액의 제조 10 ㎖ 1X DPBS에 재고 CaCl2를 277 mg을 250 mM의 CaCl2를 작업 솔루션을 준비합니다. 소위 필터4 ℃에서 0.2 μm의 필터 멤브레인 및 저장과 lution. 콜라게나 D의 1.5 U / mL로, 스파 아제 (Dispase) II 2.4 U / mL의 무 혈청 DMEM에 2.5 mM의 염화칼슘 2 (둘 베코의 수정 이글의 중간) (표 2)의 작업 솔루션을 준비합니다. 잘 혼합하고 살균을위한 0.2 μm의 필터 멤브레인을 통해 효소 솔루션을 필터링 할 수 있습니다. 사전에 효소 솔루션을 준비하고 아래로 동결 (-20 ° C) 나중에 사용하기 위해 분취한다. 2. 조직 소화 : 기계 및 효소 해리 샘플 수집에 따라, 소화 될 때까지 DPBS 4 ° C에서 근육을 유지합니다. (18) 당 콜라게나-CaCl2를 디스 파제 용액 2ml를 최소 부피 준비 – 근육 조직의 19 mg의 조직을 분리하기 전에 37 ℃로 가온. 신선한 DPBS로 세척, 간단히 70 % 에탄올에 근육 생검을 담그고 효소의 1 mL의 새로운 배양 접시에 조직을 배치해결책. 가능한 한 많은 섬유 성 지방 조직을 취소하고 작지만 구별 조각으로 빠르게 조심스럽게 근육을 눈물 (약> 0.5 mm 2) 멸균 가위 또는 수술 용 메스 (블레이드 제 10 호)과 함께. 콜라게나 제 – 디스 파제-CaCl2를 나머지 1 mL로 한 50㎖ 튜브에 시료를 옮긴다. 40 분 – 30까지 37 ° C에서 조직을 품어. 10 분 – 부드럽게 튜브 매 5 교반하여 근육 조직을 이동합니다. 코팅 매체를 사용하여 피펫을 피펫의 플라스틱의 벽에 방출 세포의 부착을 방지한다. 소화를 중지 예를 들어 멸균 성장 매체의 2 권, DMEM 20 % FBS (태아 소 혈청), 1 % L- 글루타민 및 1 % P / S (페니실린 – 스트렙토 마이신)의 4 mL로 추가합니다. 피펫 위로 5 mL를 피펫으로 아래로 여러 번 근육 섬유 세포의 방출을 도와줍니다. 참고 : 샘플은 일반적으로 완전히 작은 크기로 인해 해리된다. However, 근육의 조각이 남아있는 경우, 근육의 나머지 조각과 신선한 효소 솔루션과 함께 두 번째 배양을 사용합니다. 50 ML 원뿔 튜브를 통해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 근육의 솔루션을 필터링합니다. 스트레이너를 통해 더 많은 미디어와 필터가 남아있는 세포를 씻으십시오. 세포 펠렛을 실온에서 5 분 동안 443 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 버린다. F-12 미디어 (햄의 F-12 영양소 믹스), 20 % FBS,에 펠렛을 녹이고 10 % HS (말 혈청), 1 % P / S, 1 % α-글루타민과 2.5 NG / FGF-B의 ㎖ ( 재조합 인간 염기성 섬유 아세포 성장 인자). 여기, 60mm 페트리 접시 당 미디어의 4 mL로 사용합니다. 세포의 3 시드 이전에 인큐베이터 (섹션 1.1)에서 10 μg의 / ML의 라미닌으로 코팅 된 배양 용기를 수집합니다. 조심스럽게 배양 접시에서 라미닌의 초과를 제거하고 표면에 닿지 않도록 (또는 단백질의 구조를 방해합니다). 빨래(선택 사항) DPBS로 배양 접시. 라미닌 코팅 용기에 직접 세포를 플레이트 및 가습 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양한다. 밝은 필드 현미경 (100X 종합 배율) 다음날 하에서 세포를 시각화. 라운드 작은 세포 표면에 부착되고 남은 찌꺼기는 배양 배지에서 볼 수있다. 20 % FBS, 10 % HS, 1 % P / S, 1 % α-글루타민과 2.5 NG / FGF-B mL의 보완 신선한 F-12 미디어 매체를 변경합니다. 4. 문화와 세포의과 Passaging 3 D 자발적 피하기 위하여 셀 그룹 (7 D 후, 100 배의 총 배율이,도 2의 예를, 노인에서 세포 통로 0) 현미경으로 볼 수 자마자 셀 분할 – 미디어마다이 변경 분화. 제 1 통로 (P1)에, 20 % FBS, 10 % HS 1 % 보완 하이 글루코스 DMEM 용지로 바꾸P / S, 1 % α – 글루타민. FGF는 문화의 시작 부분에 강력한 미토 겐 중요한 요소로,이 시점에서 FGF-B를 사용하지 마십시오,하지만 문화에서 이상 사용하는 경우는 섬유 아세포의 증식을 촉진 할 수 있습니다. 세포의 계대의 경우 : 용지를 제거하고 DPBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 세포의 표면을 커버하는 0.25 %의 EDTA-트립신 최소 볼륨. 모든 셀이 박리 액에 의해 커버되도록, 실온에서 10 초 동안 부화 및 제거 부드럽게 흔들. 가습 37 °의 C에서 세포를 품어, 3, 5 % CO 2 배양기 – 5 분. 가볍게 누르고 세포가 둥근하지만 완전히 표면에서 분리되지 않도록 밝은 빛 현미경 (100X 총 배율)에서 확인하십시오. 변화가 세포에서 관찰되지 않는 경우, 추가 5 분 동안 배양한다. 5 ㎖의 성장 매체 세포를 수집하는 (고 글루코스 DMEM은 20 % FBS, 10 % HS 1 % P / S, 1 % 글루타민 α 보완)를 첨가, 혼합잘와 T75 플라스크에 새로운 미디어 세포를 전송합니다. 성장 매체의 또 다른 5 mL를이 단계 (하나 T75 플라스크에 대한 총 10 ㎖)을 반복 남아있는 세포를 씻으십시오. (제 1 통로에서 바람직) preplate 위해서는 40 분 동안, 5 % CO 2 인큐베이터 가습 37 ° C에서 세포를 배양한다. 새로운 T75 플라스크에 그들을 연결하고 부화하지 않은 세포 상층 액을 수집합니다. 섬유 아세포의 대부분이 첫 번째 플라스크에 부착해야 이것은, 근육 아세포의 문화를 풍부하게한다. 3 일 그들은 최대 수율 70 % 포화 상태에 도달하자마자 4 셀 1 분할 – 미디어마다 2를 변경합니다. 2 % HS 1 % P / S, 1 % α 글루타민 보완 하이 글루코스 DMEM을 : 분화 매체 (DM)에 배양액을 변경, 80 % 컨 플루 – 분화, 세포 일단 70 이르렀다. 7 D를 근육 모세포 (C)의 품질 및 순도에 따라 – 세포 5에서 구별되어야ulture. 5. 형질 프로토콜 씨앗 50,000 세포 / 웰의 MF (20), 노화 및 생존 분석을위한 12 웰 플레이트. 커버 전표 또는 라미닌으로 코팅 된 접시에 배양 세포. 사료된다 염색의 경우, 12 웰 플레이트에 / 잘 25,000 세포를 시드. 형질 들어, 1 ㎖의 전체 부피로 형질 감염 시약 5 μL, 마이크로 RNA 모방 제어 또는 억제제는 100nm 마이크로 RNA를 모방하거나 웰당 마이크로 RNA 억제제 100 nM 내지 100 nM의를 사용하여 제조자의 절차를 따른다. 형질 전환 후 차별화 보통 6 시간으로 변경 (높은 혈당 DMEM 2 % HS, 1 % P / S, 1 % α-글루타민 보완). 증식 실험을 위해, 형질 전환 후 세포에게 2 일 얼룩; 노화에 대한, 형질 전환 후 7 일 이내; 및 MF20 염색 용, 칠일 형질 전환 후. 세포의 면역 염색 (6) 사료된다, MyoD 및 MF (20) 면역 염색 준비 블록 1 (10% HS 0.1 % PBS에 트리톤-X) 및 PBS) 솔루션의 2 (10 % HS 0.05 % 트리톤-X를 차단합니다. 12 웰 플레이트에 잘 당 시약 500 μL를 사용합니다. 참고 : 배양 단계 쉐이커를 사용하여 다음 단계를 수행합니다. 세포에서 용지를 제거합니다. PBS로 세포를 씻어. 로커에 10 분간 냉 메탄올로 세포를 고정한다. 세포에서 메탄올을 제거하고 5 분마다 PBS로 3 배 씻어. 1 시간 동안 실온에서 로커에 셀을 블록 1 솔루션을 추가하고 품어. 일차 항체 솔루션을 추가 사료된다 염색을 위해, 사료된다에 토끼 단클론 항체를 사용 (1 : 블록 1,000 희석 2); MyoD를 들어, MyoD1 (D8G3) XP 토끼 단클론 항체를 사용 (1 : 블록 100 희석 2); MF (20) 염색, 사용 MYH1E (MF 20) 차 항체 (DSHB, 1 : 블록 1,000 희석 2). 로커에 O 1 시간 (RT) / N (4 °에 C)에 대한 일차 항체와 세포를 품어. STO 경우 여러 번 재사용 될 수있다 (주 AB 모아서빨간색) 4 ° C에서. 세포를 PBS, 5 분마다와 배 헹군다. 적절한 이차 항체를 추가 사료된다 또는 MyoD 염색, 염소 항 – 토끼 IgG를 (H + 1) 차 항체에 대한 알렉사 플 루어 488 켤레 (1 : PBS에서 1000 희석) (: PBS에서 1000 희석 1) MF (20) 염색, 염소 항 – 마우스 IgG (H + 1) 차 항체, 알렉사 형석 488 공액합니다. 세포를 포함하는 판을 싸서 실온에서 로커에 어둠 속에서 2 시간 동안 차 항체를 품어. 세포를 5 분마다 PBS로 3 배 헹군다. 세포에 : (PBS 1,000 희석 1) 5 RT에서 로커에 품어 – 10 분 DAPI 솔루션을 추가합니다. 세포를 5 분마다 PBS로 3 배 헹군다. 신선한 PBS 1 ML을 추가합니다. 장착 용액 커버 슬립에 세포를 장착 또는 증발을 방지하기 위해 파라 필름 PBS에 세포를 포함하는 플레이트를 밀봉. 4 ℃에서 보관하십시오. 함께 세포를 시각화형광 현미경 가능한 한 빨리 (늦어도 2보다 주). 생존 분석 세포에서 용지를 제거합니다. PBS에서 세포를 씻어. 1000 에티 디움 브로마이드와 1 : PBS에 희석 1,000 아 크리 딘 오렌지 하나를 추가합니다. 주의 :주의 보건 및 안전 규정 내에서 작동 – 에티 디움 브로마이드 발암 물질이다. 염색 액에 세포를 포함하는 플레이트를 감싸고 5 분간 로커에 RT에서 배양한다. 형광 현미경으로 세포의 이미지를 가지고 : 아 크리 딘 오렌지 녹색 채널을; 에티 디움 브로마이드 빨간색 채널.