誘導結合プラズマ - - レーザーアブレーションによる脳組織におけるイメージング金属質量分析法（LA-ICP-MS）

本明細書に記載される手順は、ハワード・フローリー動物倫理委員会によって承認され、動物のケアの国民健康と医学研究審議会の基準に準拠してきました。 分析のための試料の調製注：このステップは、分析される試料マトリックスに依存して変化します。 試料調製及び切片注：固定は、0.1M PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）、30％スクロース中で凍結保護を使用して組織からの金属の浸出の量を変化させることになります。具体的な詳細については、ノウサギら 19を参照してください。全てのサンプルが同一の固定及び凍結保護の工程を経ていることを確認します。 経氷冷0.1 M PBS、pH7.4で安楽死させた動物を潅流（Dodt らのメソッドを参照してください。詳細については、20）と脳を削除します。 組織を固定するために、4％PFA O / Nで脳を置きます。 <LI> Cryoprotectさらに24時間、新鮮な30％スクロースに変更その後24時間、0.1M PBS中30％スクロース中に置き、そしてによる脳。 19 少なくとも1時間、-20℃でクライオスタットで脳を凍結します。 適切なマウンティング培地を用いて、チャック上に脳をマウントします。 メタルフリー替刃（ 例えば、ポリテトラフルオロエチレン〔PTFE]はナイフをコーティングを採用）を使用して、クライオスタットのセクション脳を標準顕微鏡スライド上にマウントします。セクションのための最適な厚さは約30μmであるべきです。 所望の厚さでパラフィン包埋サンプル、セクションを使用している場合は、温水浴にリボンをフロートし、標準的な顕微鏡スライド上にマウントします。 注：長期固定と生物学的サンプルのパラフィン包埋の正確な効果は知られていません。 1.1で説明したように、比較分析が意図されている場合は、全てのサンプルが同一のサンプル調製手順を受けていることを確認します。 脱ワックスPAキシレンの3回交換でスライドを浸漬することによりラフィン包埋試料は、1変化各々100％エタノール、95％エタノール、70％エタノール及びISO 3696 3変化の最小値または同等の精製水（以下、 'と呼ばれます水';ノウサギら詳細な方法のための21）を参照してください。 このような試料でスライドボックスなどの無塵の環境で約1時間、用空気乾燥することを可能にするサンプルは、ラック内に垂直に配置され、蓋が半開き左。 マトリックスマッチ標準の調製注：以下は、以前に9を公開要約するプロトコルです。マトリックスマッチした組織の標準を調製するための詳細な手順については、元の論文を参照してください。 商業子羊の脳（または類似）を入手し、すべての血液や結合組織を除去し、水で洗い流してください。 メスを使用して、慎重に皮質TISSUの約50グラムを分析e及び部分的には、低電力のポリカーボネート使い捨てプローブと手持ち式組織ホモジナイザーを用いて均質化します。較正範囲と所望の較正点の数に応じて番号を、5gのアリコートに分けます。 0.1、1および100mgの金属ミリリットルを生成するために1％硝酸で（H 2 O・例えば、のFeSO 4）の各分析物の可溶性塩を溶解することにより、各標準をスパイクするために金属の溶液を調製-1銘柄。 でスパイクされた金属レベルの範囲を達成するために（10μgのグラム-1ウェットティッシュのおおよその最終濃度のために例えば、5μLの10mg mLの-1）5グラム等分組織に原液の事前計算されたボリュームを追加します。各標準。 各標準の所望の最終濃度に応じて、標準的に添加される溶液の最小量を確保するために、それぞれの金属ストック溶液の組み合わせを使用。エクイを確保するために、各標準への水の最終的なスパイクを追加します。価を加えた液体の体積は、それぞれの規格に存在します。 約30秒のための低消費電力にスパイクされた基準を均質化します。直ちに使用しない場合は、パラフィルムで密封蓋をポリプロピレンチューブに-20℃で凍結しておきます。 次の手順のいずれかを使用して各標準の正確な濃度および均一性を決定します。 マイクロ波分解洗浄PTFE消化槽内の標準の6正確に秤量した（約50 mg）のアリコートを配置し、濃縮し、4mLの（65％）硝酸および30％過酸化水素の1ミリリットルを加えます。密封し、30分間500 Wで消化。 消化槽を冷却した後、ヒュームフードでオープンかつ定量的に水10mLのアリコートを使用して酸洗浄を50mLチューブに消化されたソリューションを転送します。約50 mLに確認し、かつ正確に最終溶液の質量を量ります。 各標準のための2.5.1.2 – を繰り返して、2.5.1.1を繰り返します。 マイクロ波分解装置が使用できない場合は、次の手順を使用します。 酸洗浄/メタルフリーポリプロピレンチューブ及び凍結乾燥のO / Nに標準の一定分量 – 6正確に測定（200 mgの25の間）を配置します。 5分間70℃に加熱ブロックに、濃硝酸や熱、キャップなしの40μLを追加し、30％過酸化水素の10μLを加えます。さらに5分間加熱し、そしてその後、正確には、1％硝酸の950μLを使用して、1 mLの総容量になります。 注：これは、消化手順が正確であることを確認するために選択の方法を使用して、認証標準物質を消化することをお勧めします。 標準プロトコルを用いて、溶液の噴霧ICP-MSによる各ダイジェスト溶液中の金属濃度を決定します。各アリコート間の相対標準偏差（％RSD）を決定することにより、各標準の均質性を評価します。 ％RSDは15％内のすべての落下を確認してください。 EAの測定された質量を用いて、chのアリコートは、各ホモジナイズした組織の標準の正確な金属濃度を算出します。 ホモジナイズした組織の標準に戻って、5×5ミリメートルのプラスチックの使い捨て組織学の金型をパックし、 イソペンタンで凍結し、液体窒素で冷却しました。 サンプルと同じ厚さでクライオスタットにカビやセクションから凍結し、標準的な組織ブロックを削除します。 注：将来の実験のために様々な厚さでセクションの数を用意することをお勧めします。空気乾燥基準は気密及び無塵容器内に無期限に保存することができます。 分析のためのLA-ICP-MSの調製アブレーションチャンバー内の場所基準および試料は、それらがLA部に取り付けられたCCDカメラの被写界深度内にあることを確実にします。楽器のチューニングが必要な場合には、（ 例えば、ガラスでNIST 612微量元素）適切な基準材料を含みます。目を密閉するチャンバドア上の2本のネジを指で締めEアブレーションチャンバ。 ICP-MSソフトウェアでは、「メンテナンス」または類似のパネルで開いたアルゴンガスのバルブを選択し、適切なダイアログボックスに分-1 1.2 Lにキャリアガスの流量を設定します。 注：このプロトコルのアルゴンキャリアガスとして使用されます。いくつかの例は、キャリアガスとしてヘリウムまたはヘリウムとアルゴンの混合物のいずれかを使用します。エアゾールキャリアガスとしてヘリウムとアルゴンの混合物を使用するための技術的な詳細については、ギュンターとハインリッヒ22を参照してください。 LAソフトウェアでは、最低30分間アルゴンガスでセルをフラッシュする「パージ」ボタンをクリックします。 注：パージ時間は、「パージ時間」または類似のボタンをクリックすることで変更することができます。二量アブレーション細胞と焼灼システムを使用する場合、定期的に各コーナーにステージを移動し、斜めにできるだけ残留空気を確実にするために、セルを横断可能な細胞から除去されます。これは、「ホーム・ステージ」または当量を選択することによって達成することができますalent機能。 '上にプラズマ」をクリックすることで、ICP-MSをオンにして、3.5ステップ、その間に2時間、ウォームアップすることができます – 4.4を行うことができます。適切なLA-ICP-MSの動作条件の例は、うさぎらで見つけることができますが機器の設定は、製造業者の間で変化します。 10。 組織の標準の代表的アブレーションラインツールを選択して、組織表面全体に約3mm、長アブレーションの単一線を引きます。 （、スキャン速度4倍のビーム径を、ビーム（30平方μmビームが、ここで使用されているユーザによって適宜選択）直径：実験リストにアブレーションの行を右クリックし、次のように変更することにより、次のようにパラメータを設定します毎秒; 120ミクロン秒-1）およびエネルギーフルエンス（0.3 -0.5 Jのcm -2の軟組織のために、必要に応じて硬い行列に対して最適化）。 30μmの組織厚さでレーザー光が完全THICを貫通していません顕微鏡のサポートから任意の潜在的な汚染物質を排除し、この組織のネス、。炭素23への正規化は、切除組織の量の変化を補正するために使用することができます。 「デフォルト」のラジオボタンを選択することにより、後続の各ラインのデフォルトとしてこれらのパラメータを設定します。 最初の行、右クリックを選択し、「重複スキャン」を選択することで、このラインを6回複製します。ビーム径によってまたはy軸-ラインをxのいずれかにオフセットされていることを確認してください。これは、ビーム径に応じて間隔をあけ標準あたり7行の合計を、提供します。 同一の長さのラインを確保し、各規格の3.5.3 – を繰り返して、3.5.1を繰り返します。 サンプルの上にアブレーション領域を描画するには、2次のいずれかの方法に従います。 注：同一の走査パラメータ（ビーム径、走査速度、エネルギーフルエンス）を確認し、サンプルラインのために使用されます。 LAシステムが装備されている場合ビューの広い視野、ラインツールを選択し、3.5に概説したものと同じレーザパラメータを使用して、その最も広いポイントでの試料をカバーするのに十分な長さのサンプルの左上隅からの線を引きます。サンプルの完全なカバレッジを確保するために必要な回数だけビーム径に応じて間隔をあけラインと3.5.3で概説したように、このスキャンを複製します。 広視野ビューが使用できない場合は、サンプル全体をカバーする長方形の角に対応する（一般的に「ステージ位置」または類似のように、メイン画面に表示される）は、xとy座標を決定し、記録します。 3.7.1で説明したようにサンプル全体の領域をカバーする切除の平行線を配置するために、これらの座標を使用してください。 3.5で説明したプロセスを繰り返すことによって、試料を走査する〜20時間後遅くとも規格の間欠スキャンの線を描画します。試料のスキャン時間に応じてこれを複数回必要とされ得ます。 addiで実験を終了します標準の的なスキャン。 注：細胞は、パージされている間のx座標とy座標を決定する際、ホームポジションと軸の関連する較正を選択すると、以前に差に対し、xとy座標の詳細を取得した（ すなわち、ラインの長さ）が変更されます影響を受けません。 4. ICP-MSのためのデータ収集方法を設定しますアブレーションの基準線は、単一の行の合計分析時間を決定するために、レーザスキャン速度によってラインの長さを分割します。サンプルラインのためにこれを繰り返します。 ICP-MSソフトウェアでは、（「バッチ」としてここに示されている）は、新しいメソッドを作成し、「時間分解分析 'または同等が選択されていることを確認してください。検出されるm / z値を選択し、1サイクルの総積分時間は0.25秒に等しくなるように、それぞれのm / zのための積分時間を調整します。 [保存]をクリックしますバットchのように'と名前に応じて（ 例えば、STD1）。 注：サンプルは4倍のビーム径のレーザビームを横断するように、これは各質量のデータ点は、ビーム径12に相当する記録されている保証します。例えば、100μmのスポットサイズを使用して、400ミクロン秒-1 0.25秒の積分時間での走査速度は、真のピクセルサイズの画像を生成します。積分時間は感度を向上させるように調整することができます。 0.33秒スキャン速度に積分時間を増加させたときに3倍のビーム径に遅くする必要があります。 規格については、レーザーのウォームアップおよびウォッシュアウト時間を考慮して適切なボックス内の各ラインスキャンの解析時間に加え、さらに15秒を入力します。標準行の総数として、買収の同じ数（ すなわち 001、002、 など一般的に順次番号付け）でサンプル実行リスト（スキャンが実行されている、すなわち順序）を入力します。 サンプルについて、代替ファイル名で現在のメソッドまたはバッチを保存することで、規格のために使用される方法を複製し、サンプルを除去します行数と一致するように（追加の15秒を含む）の合計取得時間や買収の合計数を調整。 注：ほとんどのLA-ICP-MSシステムは、一方向のトリガー（LAはICP-MSをトリガー）を使用するように、アブレーションの次の行を開始する前に、ICP-MSソフトウェアは、LAからのトリガを待っていることが不可欠です。 ICP-MS取得ウィンドウは、「開始を待っている」として読み出されます。 5.実験を実行しますキューへの第一の方法またはバッチを追加することで、ICP-MSキューを起動して、ソフトウェアがLAシステムからのトリガを待っていることを確認します。 LAソフトウェアでは、「放射」をクリックすることにより、レーザ電源を有効に、「実行」をクリックし、該当するボックスに20秒に10秒とウォッシュアウト時間にレーザーウォームアップ時間を設定します。 注：このオーバーランがしますICP-MSは、レーザーアブレーションの後続の各ラインを開始するときに、新しいデータの取得を開始する準備ができていることを確認します。 「スタート」をクリックすることで、レーザー・シーケンスを開始します。 2容積セルを使用している場合、サンプルカップが所定の位置にあることを確認してください。 6.定量基準の計算注：画像にICP-MSデータを変換するための複数のバリエーションがあります。これらは、オープンソース言語17、24、25、商業マクロ26及びデータ解析ソフトウェアで記述された自家製のソフトウェアツールの使用を含みます。 7ここでは、特殊なLA-ICP-MSデータ分析スイート28に基づき、（ポールら 27に記載されている）、最近開発されたソフトウェアのプラグインを使用しています。 ランデータを含むすべてのバッチフォルダに転送（001.d、002.d、 など 。）へのインストール分析ソフトウェアと別のコンピュータ。別のフォルダにバッチの各ラインのための*の.csvデータファイルを抽出します。 注：自動的に新しいフォルダに*の.csvファイルを転送するスクリプトを使用することを強くお勧めします。詳細については、添付のPythonコードを参照してください。このスクリプトは、いずれかのAgilent 7700または8800シリーズICP-MSに適合するように書かれているが、他のメーカーからの出力ファイルに合わせて編集することができます。 ソフトウェアプラットフォームを開いて、以下に説明するように、定量的画像を生成するために基準をインポートし、分析するために、タブの順番に従ってください。 最初の標準バッチからデータをインポートするには、「インポート・タイプ」のため「ファイルの種類」の「アジレントの.csv '、'全体のフォルダ」を選択し、「日付形式は「コンピュータのフォーマットと同一であることを確認してください。 「インポート」をクリックして、標準の最初のセットのための.csv-ファイルを含むフォルダを選択し、「ベースライン」タブに移動します。 ベースライン引き算 、ツールバーのメインアプリケーション]ドロップダウンメニューから「自動選択」タブ（コマンド2）を使用して「インポートからの情報」を選択し、[続行]をクリックします。 「すべて選択」と統合するための「Baseline_1」を選択しクリックしてください。 、（レーザーウォームアップ時間に相当する）は、各走査線の最初の10秒を選択する第二の値が'0'と'（行の継続時間- 10秒）'を入力することにより、データをトリミングするにはおよび「統合の追加」をクリックします（ たとえば、 、35秒の走査線のために、値が「0」と「25」を入力してください）。 サンプルデータを選択するには、6.4で説明したように「自動選択」タブを使用しますが、統合として「Output_1]を選択します。バックグラウンド信号を除外するために開始し、各基準線の端からトリミングデータ（ 例えば 35秒間の走査線、値「13」と「4」を入力してください）。 possiによる信号の低下を排除するために、基準のBLE穴は、「サンプル」タブでは、信号対雑音比（ 例えば、C13またはP31）高い信号を有するチャネルを選択するために、グラフ領域の左上にある「チャンネル」をクリックします。信号内の任意の急落をメモし、それがサンプル内の通常の変動の下で十分に低いCPS値を選択するが、信号の急激な降下を選ぶのに十分に高いです。 「DRS]タブをクリックし、「現在のデータ削減計画」のための「Baseline_Subtract」を選択します。 「インデックスチャンネル」と「低信号をマスクするときに使用するしきい値」のCPS値に対して6.6からチャンネルを選択してください。 ICP-MSへのレーザからの信号伝達の遅延を考慮するために、「低信号は、前/後にトリミングする秒数」の値<0.5秒を挿入します。 低信号領域の適切なマスキングを確認するには、「サンプル」タブに戻ってクリックして処理（ 例えば 、Fe56_CPS）チャネルのトレースを選択します。 CPSと＆＃を繰り返し、洗練39;秒は、必要に応じて6.7のように低信号 '値前/後にトリミングします。 [結果]タブをクリックし、メインアプリケーションのドロップダウンメニューから「データのエクスポート]を選択します。結果のスプレッドシートデータファイル生成するファイル名を入力します（ 例えば、STD1の計算、STD2を…）。 適切なスプレッドシートプログラム内のデータファイルを開き、各チャンネルを定量するためのCPS値を計算します。各定量化できる要素に対してppmのCPS値から換算係数（μgのグラムを-1）を計算するために溶液の噴霧ICP-MSから所定の金属濃度を使用してください。 実行中のすべての標準セットに対して6.10 – を繰り返して、6.3を繰り返します。 7.定量的イメージの構築ソフトウェアを開くには、コマンドプロンプトで「Bioliteを（） 'と書きます。 「ロードイメージ」をクリックし、foは.csvファイル、ファイルを含むフォルダを選択することにより、サンプルデータをインポートサンプル画像Rをバックグラウンド補正サンプルのためのバックグラウンド補正を適用するには、「ベースライン」タブをクリックします。リン（P31）の画像は矩形描画ツールを使用して、画面上の背景の選択領域を促しました。できるだけ多くの領域を選択すると、これらの交絡因子の適切な補償を保証するために、信号/プラズマドリフトの画像全体のマップを作成します。 背景信号をより見やすくするために、グラフ編集ツールを選択（上、表示された画像の左）と右の画像をクリックしてください。 「イメージの外観を変更します」と大きな負の値（例えば -100000）に'= Zで最初の色」に変更]を選択します。 [完了]をクリックして進んでください。 CPS / ppmの補正係数のテーブルを表示するために「標準」タブをクリックします。各元素のステップ6.10で標準から計算した値を入力します。このステップは、ICP-MSで感度ドリフトを補正するのに役立ちます。 「Go]をクリックします！」 各要素と各ステップの画像を保持している「データ」タブから開く「データ・ブラウザ」。 輸出用の画像を完成させるために、「StdCorrImages」フォルダ内の所望の画像を選択し、イメージ名（* _ppm）を右クリックして、「NEWIMAGE」をクリックします。所望の色のテーブルとカラースケールを選択するには、「イメージの外観を変更する」開くには画像を右クリックします。画像を右クリックし、「注釈を追加」を選択することで、画像にカラースケールを追加します。左上のドロップダウンメニューから「ColorScaleの 'を選択し、希望のカラースケールを変更するには、タブを使用します。 画像をエクスポートするには、問題の画像が選択されていることを確認し、「ファイル」タブに移動し、クリックして「グラフィックスを保存…」。希望の形式を選択して、画像を保存します。また、選択した画像は、コピー＆ペーストツールを使用して転送することができます。 繰り返しは、関心のあるすべての画像のための7.6と7.7を繰り返します。 Quantif瑛別個の領域 ROIツールを有効にするには、「分析」タブ、「パッケージ」に移動して、「画像処理」を選択します。 所望の画像を選択し、「イメージ」タブに移動し、クリックして「ROIを…」。 「スタートROIドロー」をクリックして、試料中の関心領域を選択するために、描画ツールを使用します。描画を終了するには、[完了ROI」をクリックします。 選択されたROIの統計情報を取得するには、「イメージ」タブに移動し、クリックして「統計を…」。 別々のスプレッドシートに結果をコピーして貼り付けます。すべての地域と関心の要素を繰り返しROIの選択（7.9.2）。