In Situ Upptäckt och enda Cell kvantifiering av metalloxid nanopartiklar med nukleära Microprobe analys
Summary
Vi beskriver en procedur för detektion av kemiska grundämnen närvarande i situ i mänskliga celler samt deras in vitro- kvantifiering. Metoden är väl lämpad att vilken celltyp och är särskilt användbart för kvantitativa kemiska analyser i enstaka celler efter i vitro metalloxid nanopartiklar exponering.
Abstract
Micro-analytiska tekniker baserat på grundämne imaging aktiverar lokalisering och kvantifiering av kemiska sammansättning på cellnivå. De erbjuder nya möjligheter för karakterisering av levande system och är särskilt lämplig för att upptäcka, lokalisera och kvantifiera förekomsten av metalloxid nanopartiklar både i biologiska prover och miljön. Faktiskt, dessa tekniker som alla uppfyller relevanta krav i fråga om (i) känslighet (från 1 upp till 10 µg.g-1 i torrvikt), (ii) mikrometer spänna rumsliga upplösningen och (iii) flera element upptäckt. Med tanke på dessa egenskaper, microbeam grundämne imaging kan kraftfullt komplettera rutinmässiga avbildningstekniker såsom optisk och fluorescensmikroskopi. Det här protokollet beskriver hur du utför en nukleär microprobe analys på odlade celler (U2OS) exponeras för nanopartiklar av titandioxid. Cellerna måste växa och exponeras direkt i en specialdesignad provhållaren som används på det optiska mikroskopet och i de nukleära microprobe analysis stadierna. Plunge-frysa kryogen fixering av proverna bevaras både cellulära organisationen och grundämne distribution. Samtidiga nukleära microprobe analys (skanning överföring ion mikroskopi, Rutherford backscattering spektrometri och partikel inducerad röntgenstrålning) utförs på prov ger information om cellulära densiteten, den lokala fördelningen av de kemiska grundämnena som cellulära innehållet av nanopartiklar. Det finns ett växande behov av sådana analytiska verktyg inom biologi, särskilt inom framväxande nanotoxikologi och nanomedicin som vår förståelse av samspelet mellan nanopartiklar och biologiska prover måste fördjupas. I synnerhet som nukleära microprobe analys inte kräver nanopartiklar märkas, är nanopartiklar sammansättning mätbara nivån i enskild cell i en cell befolkningen, oberoende av deras ytbehandla statligt.
Introduction
Cellulära homeostas bestäms av upptag kontroll, assimilering och intracellulära lokalisering av olika spårämnen (joner, metaller, exogena oorganiska föreningar). Dessa komponenter är ofta i form av spår, men ändå kan ha en betydande inverkan i systemet fysiologi. Studien av cell biokemi i både normala och patologiska/stressade situationer är således ett nyckel-steg mot en övergripande förståelse för cellulära metaboliska mekanismer. Utvecklingen av imaging och analytiska tekniker som gör det möjligt för utredning av intracellulära kemisk sammansättning, strukturella organisationen och deras relaterade metabola funktioner blir därför nödvändigt. Mycket få metoder kan ge en i situ kvantitativa bit av information rörande ett givet prov övergripande kemiska natur. Förutom metoder analysera prover i formuläret bulk, i situ analyser överväga biologiska prover i deras integrality utan att förlora vikt och strukturell information, därigenom bevara deras kemiska beståndsdelar (spårämnen och joner) och proteiner. Dessutom nanovetenskapen fortsätter att utveckla, kommer förbättrad bildhantering och analysmetoder för miljöövervakning på cellulär nivå att behöva iaktta och kvantifiera nano-objekt beteenden och interaktioner. 1
Nanopartiklar (NPs) har definierats som objekt som uppvisar minst en ansiktsbehandling dimension i intervallet 1 och 100 nm. 2 på grund av deras särskilt fysikalisk-kemiska egenskaper, NPs flitigt inom industrin. NPs är anställda i bio-applikationer och nanomedicin. 3 , 4 trots NPs talrika fysikalisk-kemiska egenskaper, kan de generera vissa risker för negativa effekter på människors hälsa och miljön. Dessa risker kan induceras av både långvarig och upprepad exponering vid olika koncentrationsnivåer och detta har ännu inte klart fastställts. 5 , 6 , 7 , 8 i synnerhet öde NPs inuti celler och de associerade cellulära svar är, hittills, inte fullständigt beskrivna. Detta beror delvis på brist på metoder som tillåter detektion och kvantifiering av internaliserade NPs i en enda cell. 9
De klassiska analytiska verktyg som används för att uppskatta den cellulära dosen av nanopartiklar är microscopies, masspektrometri (MS), kopplad induktivt plasma MS (ICP-MS)10,11 och vätskekromatografi MS (LC-MS), men de ger bara matnyttigt på makroskopiska skalan. Ingen av dem kan ge en noggrann utvärdering av subcellulär NPs innehållet heller NPs fördelningen utan användning av fraktionering metoder. En systematisk bedömning av dos-respons är således omöjligt med dessa metoder, i motsats till metoder baserade på atomspektroskopi såsom nukleära microprobe analysis12,13, synchrotron X-ray fluorescensmikroskopi14 , och sekundära Ion Mass Spectrometry (SIMS). 15 , 16 dessa metoder är särskilt intressant eftersom de kompletterar observationer gjorda med fluorescensmikroskopi, särskilt när NPs inte märkas med fluorescerande molekyler och därmed studeras i sitt ursprungliga tillstånd. I viss mån även när NPs ympas med fluorophores, förblir (i) kvantifiering svårt eftersom taggning per NP är okänd och (ii) kemisk modifiering av NP ytan kan ändra dess cellulära distribution.
I denna artikel, vi fokuserar på en metod som bygger på en kombination av nukleära microprobe tekniker syftar till att imaging av morfologi och elementärt sammansättning av biologiska prover i dur, moll, och spåra koncentrationer.
Nukleära microprobe analys visar sig vara särskilt lämpliga för mätning av kemiska spårämnen i biologisk vävnad. Både beam lateral upplösning (0,3 till 1 µm) och känslighet i grundämne upptäckt (från 1 till 10 µg.g-1 torr massa) är väl lämpade för studier på cellulär nivå. Nukleära microprobe tekniker baseras på partiklar upptäckt (fotoner, elektroner, joner) som släpps ut efter den ion beam (vanligtvis kör på MeV energier) interagerar med atomer i provet. Interaktioner som sker i cellerna är främst: 1) excitation/jonisering av atomer följt av ett utsläpp av fotoner efter atomer återvända till sitt grundläggande tillstånd; och 2) diffusion av inkommande partiklar som leder till förändring i deras energi och riktning. Mätning av utsläppta partikel energi allowsthe identifiering av atomer som är inblandad i interaktionen. För att utföra kartläggning av element, söks den ion microbeam upprepade gånger över provet ytan, ofta över ett område på ca 100 av 100 µm2 innehållande flera celler. Utsläppta partiklar upptäcks och deras energi registreras för varje balk position. Sortering av partiklar enligt balken position, är således identifiera strukturen som ansvarar för utsläpp av sådana partiklar syftet med data behandling. Här beskriver vi just en strategi baserad på fluorescensmikroskopi och nukleära microprobe analys att upptäcka samt att kvantifiera exogena NPs på de cellulära och sub cellulära skalorna, för att undersöka konsekvenserna av NP interaktioner med levande system. Vi ska särskilt fokusera på de möjligheter som erbjuds genom denna metod när det gäller i situ kvantifiering av titandioxid nanopartiklar (TiO2 NPs) aggregat på subcellulär nivå.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en metod att ge användbar information utöver vad som är möjligt med andra avbildningstekniker, särskilt på subcellulär nivå. Förutom sin imaging förmåga erbjuder nukleära microprobe analysis också möjligheter för kvantifiering av kemiska beståndsdelar in i sammansättningen av ett biologiskt prov. I detta arbete, vi har studerat mänsklig cellpopulationer och fokuserar ner till analysen av ett valt område av intresse baserat på en enda cell utsätts för TiO2 NPs. Dess kombinatio…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Serge Borderes för regi och redigering av video. Franska National Research Agency stöder forskningsprogrammet Titan (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01). Även ”stöd av offentlig och industriell forskning med hjälp Ion Beam teknik (Anden)” enligt EG kontrakt n ° 227012 CNRS och Europeiska gemenskapen som att integrera verksamhet. Detta arbete har stötts av Marie Curie-åtgärder – Initial Training Networks (ITN) som en ”integrera verksamhet stödja forskarutbildning forskning med praktik i branschen och utbildning Excellence” (SPRITE, D1.3) kontrakterade EG nr 317169. Den C’NANO Grand Sud Ouest och den regionen Aquitaine stöder forskningsprogrammet TOX-NANO (n ° 20111201003) och forskningsprogrammet POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
Referencias
- Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
- Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
- Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
- Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
- Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety – A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
- Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies – A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
- Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
- Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
- Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
- Olesik, J. W. . Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , (2014).
- Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
- Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
- Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
- Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
- Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
- Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
- Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
- Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
- Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
- Mayer, M. . SIMNRA User’s Guide, Report IPP 9/113. , (1997).
- Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
- Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).
