Clostridium difficile är en av de viktigaste orsakerna till sjukhus antibiotika-associerad diarré infektioner ^1. Detta grampositiva anaeroba bakterien överförs genom sitt spor form via fekal-oralt. Under det senaste decenniet, nya "" epidemi " 'eller' 'hypervirulent' 'stammar (t.ex. BI / NAP1 / 027) orsakade en drastisk ökning av nya infektioner och dödligheten i Nordamerika och Europa ^2. C. difficile -associated sjukdom (CDAD) är en livshotande kolon inflammation med hög dödlighet ^3. Symptomen varierar från diarré ⁴ till pseudomembranös kolit ⁵ och ofta dödlig toxisk megakolon ^6.

Behandling av CDAD är svårt eftersom de virulenta stammar är multiresistenta och återfallsfrekvensen är hög ^7. Just nu terapi inkluderar antibiotika metronidazol, fidaxomicin eller vankomycin, eller i repetitidevis återkommande fall fekal mikrobiota transplantation. Nya behandlingsstrategier finns ett stort behov ^8. Vissa framsteg registreras som den terapeutiska monoklonala antikroppen Bezlotoxumab, med inriktning på C. difficile toxin B ^9, har nyligen klarat kliniska fas III-studier och ansökt om godkännande hos FDA och EMA. Dessutom är nya antibiotika testas just nu i olika stadier av kliniska prövningar ^10.

Att utveckla effektiv behandling nya terapeutiska mål måste identifieras. Den nyupptäckta C. difficile proteas prolin-prolin endopeptidas-1 (PPEP-1, CD2830 / Zmp1, EC 3.4.24.89) är en sådan lovande mål, eftersom bristen på PPEP-1 i en knock-out-stammen minskar virulens hos C . difficile in vivo ^11. PPEP-1 är ett utsöndrat metalloproteas ^12,13 klyva två C. difficile adhesiner vid sina C-terminus ¹³ därmed frigör vidhäftande bacterbl.a. från den mänskliga tarmen epitel. Därför är det involverat i att upprätthålla balansen mellan fastsittande och rörliga fenotyp av C. difficile. Att utveckla selektiva hämmare mot PPEP-1 och för att förstå hur den känner igen sina substrat ingående kunskap om dess tredimensionella strukturen oumbärlig. Vi har löst den första kristallstrukturen för PPEP-1 ensamma och i komplex med en substratpeptid ^14. PPEP-1 är den första kända proteas som selektivt klyver peptidbindningar mellan två prolinrester ^15. Det binder substratet i en dubbel-kinked sätt och stabiliserar den via en utsträckt alifatisk-aromatisk nätverk av rester belägna i S-slinga som täcker proteaset aktiva stället ^14. Detta substrat-bindningssätt är unikt för PPEP-1 och inte återfinns i humana proteaser hittills. Detta gör det till ett lovande läkemedelsmål och off-target effekterna av inhibitorer mycket osannolikt.

Att utveckla och skärm selektiv PPEP-1 invibitors i framtiden behövs en stor mängd av rent och monodispersa PPEP-1-proteinet. Vidare, för att bestämma läget av bindning av första inhibitorer, co-kristallstrukturer med PPEP-1 kommer att behöva bestämmas. I våra händer PPEP-1 producerar ständigt sammanväxta kristaller. Således har vi utvecklat en optimeringsprocedur för att producera enskilda diffraktion kvalitet kristaller av PPEP-1. I detta protokoll beskriver vi i detalj produktion, rening, kristallisation och struktur lösning av PPEP-en ^14. Vi använder intracellulär uttryck i Escherichia coli av en PPEP-1-varianten saknar sekretionssignalsekvens, affinitetskromatografi och gelkromatografi med borttagning av reningsmarkör, följt av microseeding ¹⁶ till en optimering skärm och strukturbestämning via zink enda våglängd avvikande dispersion (zink-SAD) ^17. Detta protokoll kan anpassas för produktion och strukturbestämning av andra proteiner (t.ex. </ Em> metalloproteaser), särskilt för proteiner som producerar sammanväxta kristaller. På begäran, plasmid DNA från konstruktionen (pET28a-NHis-rPPEP-1) och diffraktion uppgifter kan tillhandahållas för utbildningsändamål.