Clostridium difficile é uma das principais causas de infecções diarreia associada a antibióticos nosocomiais ^1. Esta bactéria anaeróbia Gram-positiva são transmitidos através da sua forma de esporos através da via fecal-oral. Na década passada, o novo '' epidemia '' ou '' hipervirulento '' estirpes (por exemplo BI / NAP1 / 027) causou um aumento drástico em novas infecções e taxas de mortalidade na América do Norte e na Europa ^2. C. doença -associated difficile (CDAD) é uma ameaça à vida inflamação do cólon com altas taxas de mortalidade ^3. Os sintomas variam de ⁴ a diarreia colite pseudomembranosa ⁵ e o megacólon tóxico, muitas vezes fatal ^6.

Tratamento de CDAD é difícil, pois as estirpes virulentas são multi-resistente ea taxa de recorrência é alta ^7. No momento em terapia inclui a antibióticos metronidazol, vancomicina ou fidaxomicina, ou em repetiticasos recorrentes vely transplante de microbiota fecal. Novas estratégias terapêuticas são urgentemente necessários ^8. Algum progresso está registada como a terapêutica anticorpo monoclonal Bezlotoxumab, visando C. difficile Toxina B ^9, foi recentemente passou com êxito ensaios clínicos fase III e foi apresentado para aprovação com a FDA e EMA. Adicionalmente, novos antibióticos estão a ser testado no momento em diferentes fases de ensaios clínicos ^10.

Para desenvolver um tratamento eficaz novos alvos terapêuticos devem ser identificados. O recém-descoberto C. difficile protease endopeptidase-1 prolina-prolina (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) é um alvo tão promissor, como a falta de PPEP-1 em uma cepa knock-out diminui virulência de C . difficile in vivo ^11. PPEP-1 é uma metaloprotease segregada ^12,13 clivagem dois adesinas de C. difficile no seu terminal C ^13, libertando assim o bacter aderenteIA a partir do epitélio do intestino humano. Portanto, está envolvido na manutenção do equilíbrio entre o fenótipo séssil e móveis de C. difficile. Para desenvolver inibidores selectivos contra PPEP-1 e para entender como ele reconhece seus substratos conhecimento íntimo de sua estrutura tridimensional é indispensável. Nós resolvemos a primeira estrutura cristalina de PPEP-1 sozinho e em complexo com um péptido substrato ^14. PPEP-1 é a protease primeiro conhecido que cliva selectivamente ligações peptídicas entre os dois resíduos de prolina ^15. Liga-se o substrato de um modo duplamente dobrada e estabiliza através de uma rede alifático-aromático prolongado de resíduos localizados no S-ciclo que abrange o local de protease activa ^14. Este modo de ligação de substrato é exclusivo para PPEP-1 e não foi encontrado na proteases humanos até à data. Isto o torna um alvo terapêutico promissor, e fora do alvo efeitos de inibidores muito improvável.

Para desenvolver e tela seletiva PPEP-1 habibitors no futuro, é necessária uma grande quantidade de proteína pura e monodispersas PPEP-1. Além disso, para determinar o modo de ligação dos primeiros inibidores, as estruturas de co-cristal com PPEP-1 terão de ser determinados. Em nossas mãos PPEP-1 produz constantemente cristais solidamente incorpora-. Assim, desenvolvemos um procedimento de optimização para produzir cristais de difracção de qualidade individuais de PPEP-1. Neste protocolo, descrever em detalhes a solução de produção, purificação, cristalização e estrutura da PPEP-1 ^14. Utilizamos a expressão intracelular em Escherichia coli de uma variante PPEP-1 sem a sequência de sinal de secreção, cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho, com a remoção do marcador de purificação, seguido por microdispersão ¹⁶ para uma tela de optimização e a determinação da estrutura por meio de zinco-comprimento de onda único de dispersão anómala (zinco-SAD) ^17. Este protocolo pode ser adaptado para a produção e a estrutura determinação de outras proteínas (por exemplo, </ Em> metaloproteases) e, em particular, para as proteínas produtoras de cristais solidamente incorpora-. No pedido, DNA plasmídeo da construção (pET28a-NHis-rPPEP-1) e dados de difração pode ser fornecida para finalidades educacionais.