Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione<em> C. difficile</em> PPEP-1 tramite Microseeding e Zinco-SAD
Summary
Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.
Abstract
New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.
Introduction
Clostridium difficile è una delle principali cause di infezioni nosocomiali diarrea associata agli antibiotici 1. Questo batterio anaerobico Gram-positivi si trasmette attraverso la sua forma di spore per via fecale-orale. Negli ultimi dieci anni, il nuovo '' epidemia '' o '' ipervirulento '' ceppi (ad es BI / NAP1 / 027) ha causato un drastico aumento delle nuove infezioni e il tasso di mortalità in Nord America e in Europa 2. C. malattia -associated difficile (CDAD) è un pericolo di vita infiammazione del colon con alti tassi di mortalità 3. I sintomi variano da diarrea 4 a colite pseudomembranosa 5 e il megacolon tossico spesso fatale 6.
Il trattamento di CDAD è difficile in quanto i ceppi virulenti sono multi-resistente e il tasso di recidiva è alto 7. Al momento terapia include il metronidazolo antibiotici, fidaxomicina o vancomicina, o in repetitiVely casi ricorrenti di trapianto microbiota fecale. Nuove strategie terapeutiche sono urgentemente necessari 8. Alcuni progressi viene registrato come il anticorpo monoclonale terapeutico Bezlotoxumab, il targeting tossina di C. difficile B 9, ha recentemente superato con successo di fase III di sperimentazione clinica ed è stato depositato per l'approvazione con la FDA ed EMA. Inoltre, nuovi antibiotici sono in fase di sperimentazione in questo momento nelle diverse fasi della sperimentazione clinica 10.
Per sviluppare un trattamento efficace devono essere identificati nuovi bersagli terapeutici. La recente scoperta da C. difficile proteasi endopeptidasi-1 prolina-prolina (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) è un obiettivo così promettente, come la mancanza di PPEP-1 in un ceppo knock-out diminuisce la virulenza di C . difficile in vivo 11. PPEP-1 è una metalloproteasi secreta 12,13 fendendo due adesine C. difficile al loro C-terminale 13 liberando così il Bacter aderentiia dal epitelio intestinale umano. Pertanto, è coinvolto nel mantenere l'equilibrio tra il fenotipo sessili e motilità di C. difficile. Per sviluppare inibitori selettivi contro PPEP-1 e per capire come riconosce i suoi substrati intima conoscenza della sua struttura tridimensionale è indispensabile. Abbiamo risolto la prima struttura cristallina di PPEP-1 solo e in complesso con un peptide substrato 14. PPEP-1 è la proteasi prima noto che selettivamente scinde i legami peptidici tra due residui di prolina 15. Si lega il substrato in doppio-piegato e stabilizza tramite una rete alifatico-aromatici estesa di residui ubicata nella S-ciclo che copre la proteasi sito attivo 14. Questa modalità substrato vincolante riservate PPEP-1 e non trovato in proteasi umane fino ad oggi. Questo lo rende un bersaglio promettente farmaco, e off-bersaglio effetti degli inibitori molto improbabili.
Per sviluppare e schermo selettivo PPEP-1 inhibitors in futuro è necessario una grande quantità di puro e monodisperse PPEP-1 proteina. Inoltre, per determinare la modalità di legame dei primi inibitori, strutture co-cristalline con PPEP-1 dovrà essere determinato. Nelle nostre mani PPEP-1 produce costantemente cristalli intergrown. Così abbiamo sviluppato una procedura di ottimizzazione per produrre cristalli singoli di diffrazione qualità di PPEP-1. In questo protocollo si descrive in dettaglio la soluzione di produzione, purificazione, cristallizzazione e la struttura di PPEP-1 14. Usiamo espressione intracellulare in Escherichia coli di una variante PPEP-1 privo della sequenza segnale di secrezione, cromatografia di affinità e cromatografia ad esclusione sterica con la rimozione del tag purificazione, seguita da microseeding 16 in uno schermo ottimizzazione e determinazione della struttura tramite zinco singola lunghezza d'onda di dispersione anomala (zinco-SAD) 17. Questo protocollo può essere adattato per la determinazione della struttura produttiva e di altre proteine (ad esempio </ Em> metalloproteasi), in particolare per le proteine che producono cristalli intergrown. Su richiesta, il plasmide DNA del costrutto (pET28a-NHIS-rPPEP-1) dati di diffrazione e può essere fornita per scopi didattici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cristallografia a raggi X è ancora il metodo più veloce e più accurato per determinare tridimensionali strutture risoluzione quasi atomica delle proteine 28. Tuttavia, esso richiede la crescita di cristalli singoli ben ordinate. Questi sono spesso difficili da ottenere e stato cristallino è artificiale. Tuttavia, un confronto di strutture proteiche determinata mediante cristallografia a raggi X con quelle determinate con altri metodi, in particolare NMR, generalmente mostra un ottimo accordo. Nel caso di …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il personale del X06DA linea di luce alla sorgente Swiss Light, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Svizzera per il supporto durante la raccolta dei dati di sincrotrone. Siamo grati a Monika Gompert per un eccellente supporto tecnico. Il progetto è stato sostenuto dall'Università di Colonia e concedere INST 216 / 682-1 FUGG dal Consiglio di ricerca tedesco. Una borsa di studio di dottorato presso la Graduate School Internazionale in Sviluppo salute e malattia a CP è riconosciuto. La ricerca che ha portato a questi risultati è stata finanziata dal Settimo Programma Quadro della Comunità Europea (FP7 / 2007-2013), contratto di sovvenzione n ° 283.570 (BioStruct-X).
Materials
| Genes / Vectors / cell strains | |||
| pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
| E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
| Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Yeast extract | any | ||
| Tryptone | any | ||
| Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
| Agar | any | ||
| Kanamycin | any | ||
| IPTG | AppliChem | A1008 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
| NaCl | any | Buffer grade | |
| DNaseI | AppliChem | A3778 | |
| Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
| Glycerol 100% | any | purest grade | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (general) | |||
| Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C – 37 °C | |
| Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml – 2.8L) | |
| Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
| Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
| Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150.000 x g | |
| NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
| Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
| Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
| Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
| Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
| Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
| Ultrafiltration units (concentrators) 10.000 NWCO | any | ||
| UV-Vis spectrophotometer | any | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (crystallography) | |||
| Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
| Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
| Crystallization robot | any | ||
| 96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
| 24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
| Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
| Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
| Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
| Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
| JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
| CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm – 0.5 mm |
| CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
| Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
| Cryogenic Foam Dewar 2L | Hampton Research | HR4-675 | |
| Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
| CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
| CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
| CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
| CryoCane Color Coder – White | Hampton Research | HR4-713 | |
| Scalpel | any | ||
| Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
| Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
| Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |
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