Clostridium difficile er en af de hyppigste årsager til nosokomielle antibiotikum-associeret diarré infektioner ^1. Dette Gram-positive anaerobe bakterie overføres gennem sin sporen form via det fækale-oral vej. I det seneste årti, nye '' epidemi '' eller '' hypervirulente '' stammer (f.eks BI / NAP1 / 027) forårsagede en drastisk stigning i nye infektioner og dødelighed i Nordamerika og Europa ^2. C. difficile-associeret sygdom (CDAD) er en livstruende kolon inflammation med høje dødelighed ^3. Symptomerne spænder fra diarré ⁴ til pseudomembranøs colitis ⁵ og ofte fatal toksisk megacolon ^6.

Behandling af CDAD er svært som de virulente stammer er multiresistent og fornyet er høj ^7. I øjeblikket terapi omfatter antibiotika metronidazol, fidaxomicin eller vancomycin, eller i repetitiholdsvis tilbagevendende sager fækal mikrobiota transplantation. Nye terapeutiske strategier er et presserende behov ^8. Visse fremskridt er registreret som den terapeutiske monoklonale antistof Bezlotoxumab, rettet mod C. difficile toksin B ^9, har for nylig bestået kliniske fase III studier og blev indgivet til godkendelse hos FDA og EMA. Derudover er nye antibiotika, der testes i øjeblikket på forskellige stadier af kliniske forsøg ^10.

At udvikle effektiv behandling skal identificeres nye terapeutiske mål. Den nyligt opdagede C. difficile protease prolin-prolin endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1, EF 3.4.24.89) er sådan en lovende mål, som den manglende PPEP-1 i en knock-out stammen reducerer virulens C . difficile in vivo ^11. PPEP-1 er et secerneret metalloprotease ^12,13 spaltning to C. difficile adhæsiner ved deres C-terminus ¹³ derved frigør det vedhængende Bacterbl.a. fra det menneskelige tarm epitel. Derfor er det involveret i at opretholde balancen mellem siddende og bevægelige fænotype af C. difficile. At udvikle selektive inhibitorer mod PPEP-1 og til at forstå, hvordan det anerkender sine substrater indgående kendskab til sin tredimensionelle struktur er uundværlig. Vi har løst den første krystalstruktur PPEP-1 alene og i kompleks med et substrat peptid ^14. PPEP-1 er den første kendte protease der selektivt spalter peptidbindinger mellem to prolinrester ^15. Det binder substratet i en dobbelt-bøjet måde og stabiliserer det via en udvidet alifatisk-aromatisk netværk af rester placeret i S-sløjfe, der omfatter protease aktive sted ^14. Dette substrat-bindende tilstand er unik for PPEP-1 og ikke fundet i humane proteaser til dato. Dette gør det en lovende lægemiddel mål, og off-target effekter af inhibitorer meget usandsynlige.

At udvikle og skærm selektiv PPEP-1 inhibitors i fremtiden er behov for en stor mængde af ren og monodisperse PPEP-1 protein. Endvidere at bestemme tilstanden af ​​binding af første inhibitorer, co-krystalstrukturer med PPEP-1 skal bestemmes. I vores hænder PPEP-1 konstant producerer sammenvoksede krystaller. Vi har således udviklet en optimering procedure til fremstilling af enkeltkædede diffraktion kvalitet krystaller af PPEP-1. I denne protokol vi beskriver i detaljer produktion, rensning, krystallisering og struktur løsning af PPEP-1 ^14. Vi bruger intracellulær ekspression i Escherichia coli af et PPEP-1-varianten mangler sekretionssignalsekvens, affinitetskromatografi og gelpermeationskromatografi med fjernelse af rensning tag, efterfulgt af mikropodning ¹⁶ ind en optimering skærm og strukturbestemmelse via zink enkelt bølgelængde anomale dispersion (zink-SAD) ^17. Denne protokol kan tilpasses til produktion og strukturbestemmelse af andre proteiner (f.eks </ Em> metalloproteaser), særlig for proteiner producerer sammenvoksede krystaller. På anmodning, plasmid-DNA af konstruktionen (pET28a-NHis-rPPEP-1) og diffraktionsdata kan leveres til undervisningsformål.