إنتاج وبلورة وتحديد هيكل<em> C. صعب</em> PPEP-1 عن طريق Microseeding والزنك والصحراء
Summary
Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.
Abstract
New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.
Introduction
المطثية العسيرة هي واحدة من الأسباب الرئيسية للنوسكميل المرتبطة المضادات الحيوية عدوى الإسهال 1. تنتقل هذه البكتيريا اللاهوائية إيجابية الجرام من خلال شكل بوغ لها عن طريق الفم برازي الطريق. في العقد الماضي، جديدة '' باء '' أو '' hypervirulent '' سلالات (على سبيل المثال BI / NAP1 / 027) تسبب في زيادة كبيرة في الإصابات الجديدة ومعدلات الوفيات في أمريكا الشمالية وأوروبا 2. جيم المرض -associated العسيرة (CDAD) هي التي تهدد الحياة التهاب القولون مع معدلات وفيات عالية 3. وتتراوح الأعراض من الإسهال 4 إلى التهاب القولون الغشائي الكاذب (5) وتضخم القولون السامة غالبا ما تكون قاتلة 6.
علاج CDAD صعبة كما سلالات ضراوة مقاومة للأدوية المتعددة ومعدل تكرار مرتفع 7. وفي يشمل العلاج اللحظة ميترونيدازول المضادات الحيوية، fidaxomicin أو فانكومايسين، أو في repetitiالحالات المتكررة vely البراز زرع الجراثيم. هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات علاجية جديدة 8. يتم تسجيل بعض التقدم كما العلاجية الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بزلوتوكسوماب، تستهدف جيم السم العسيرة ب 9، مؤخرا اجتاز بنجاح المرحلة الثالثة من التجارب السريرية ورفعت للموافقة عليها مع ادارة الاغذية والعقاقير وEMA. بالإضافة إلى ذلك، يتم اختبار مضادات حيوية جديدة في الوقت الراهن في مراحل مختلفة من التجارب السريرية 10.
لتطوير علاج فعال يجب تحديد الأهداف العلاجية الجديدة. واكتشفت مؤخرا جيم ببتيداز داخلية-1 البروتيني العسيرة البرولين البرولين (PPEP-1؛ CD2830 / Zmp1، EC 3.4.24.89) مثل هذا الهدف واعد، وعدم وجود PPEP-1 في سلالة خروج المغلوب يقلل ضراوة C . صعب في الجسم الحي 11. PPEP-1 هو metalloprotease يفرز 12،13 الشق اثنين جيم adhesins صعب في اجتماعهم محطة سي 13 وبالتالي الإفراج عن bacter ملتصقةالجيش العراقي من ظهارة الأمعاء الإنسان. وبالتالي، فإنه يشارك في الحفاظ على التوازن بين النمط الظاهري لاطئة ومتحركة من جيم صعب. لتطوير مثبطات انتقائية ضد PPEP-1 وأن نفهم كيف أنها تعترف ركائز لها معرفة وثيقة من هيكلها ثلاثي الأبعاد أمر لا غنى عنه. لقد تمكنا من حل التركيب البلوري الأول من PPEP-1 وحده، وفي مجمع مع الببتيد الركيزة 14. PPEP-1 هو الأنزيم البروتيني الأولى المعروفة التي انتقائي يشق روابط الببتيد بين اثنين من مخلفات البرولين 15. فإنه يلزم الركيزة بطريقة مزدوجة متلوى واستقرار ذلك عن طريق شبكة الأليفاتية العطرية طويلة من المخلفات الموجودة في S-الحلقة التي تغطي الموقع البروتيني نشط 14. هذا الوضع ملزم الركيزة هي فريدة من نوعها لPPEP-1 والتي لا توجد في البروتياز الإنسان حتى الآن. وهذا ما يجعل منه هدفا المخدرات واعدة، وبعيدا عن الهدف آثار مثبطات المستبعد جدا.
لتطوير وشاشة انتقائية PPEP-1 يلعنهibitors في المستقبل هناك حاجة إلى كمية كبيرة من الذهب الخالص وmonodisperse PPEP-1 البروتين. وعلاوة على ذلك، لتحديد طريقة الربط من مثبطات الأولى، وهياكل التعاون وضوح الشمس مع PPEP-1 سوف يتعين تحديدها. في أيدينا PPEP-1 تنتج باستمرار بلورات intergrown. وهكذا وضعنا إجراء الأمثل لإنتاج بلورات واحدة ذات جودة حيود PPEP-1. في هذا البروتوكول وصفنا في التفاصيل الحل إنتاج وتنقية والبلورة وهيكل PPEP-1 14. نحن نستخدم تعبير الخلايا في القولونية من البديل PPEP-1 التي تفتقر إلى تسلسل إشارة إفراز، اللوني تقارب وحجم الإقصاء اللوني مع إزالة العلامة تنقية، تليها microseeding 16 إلى شاشة الأمثل وتحديد هيكل عبر الزنك والطول الموجي واحد تشتت الشاذة (والزنك SAD) 17. ويمكن تكييف هذا البروتوكول للإنتاج وهيكل تحديد البروتينات الأخرى (على سبيل المثال </ م> metalloproteases) وعلى وجه الخصوص للبروتينات ينتج بلورات intergrown. بناء على طلبها، DNA البلازميد للبناء (pET28a-NHIS-rPPEP-1) البيانات الحيود ويمكن توفير لأغراض تعليمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأشعة السينية البلورات لا تزال هي الطريقة الأسرع والأكثر دقة لتحديد الهياكل قرار بالقرب الذرية ثلاثية الأبعاد للبروتينات 28. ومع ذلك، فإنه يتطلب نمو البلورات واحدة امر جيد. هذه غالبا ما تكون صعبة للحصول على والدولة البلورية هي مصطنعة. ومع ذلك، فإن المقارنة بين…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الموظفين في X06DA خط الأشعة في المصدر السويسري الخفيفة، بول شيرر، معهد، Villigen، سويسرا للحصول على دعم خلال جمع البيانات السنكروترون. ونحن ممتنون لمونيكا غومبرت حصول على الدعم الفني الممتاز. تم دعم المشروع من قبل جامعة كولونيا ومنح INST 216 / 682-1 FUGG من مجلس البحوث الألمانية. ومن المسلم به زمالة الدكتوراه من كلية الدراسات العليا الدولية في الصحة التنمية ومرض لCP. تلقت البحوث المؤدية إلى هذه النتائج بتمويل من برنامج الإطار السابع للجماعة الأوروبية (FP7 / 2007-2013) بموجب اتفاقية منحة رقم 283570 (BioStruct-X).
Materials
| Genes / Vectors / cell strains | |||
| pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
| E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
| Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Yeast extract | any | ||
| Tryptone | any | ||
| Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
| Agar | any | ||
| Kanamycin | any | ||
| IPTG | AppliChem | A1008 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
| NaCl | any | Buffer grade | |
| DNaseI | AppliChem | A3778 | |
| Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
| Glycerol 100% | any | purest grade | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (general) | |||
| Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C – 37 °C | |
| Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml – 2.8L) | |
| Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
| Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
| Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150.000 x g | |
| NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
| Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
| Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
| Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
| Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
| Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
| Ultrafiltration units (concentrators) 10.000 NWCO | any | ||
| UV-Vis spectrophotometer | any | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (crystallography) | |||
| Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
| Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
| Crystallization robot | any | ||
| 96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
| 24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
| Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
| Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
| Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
| Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
| JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
| CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm – 0.5 mm |
| CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
| Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
| Cryogenic Foam Dewar 2L | Hampton Research | HR4-675 | |
| Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
| CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
| CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
| CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
| CryoCane Color Coder – White | Hampton Research | HR4-713 | |
| Scalpel | any | ||
| Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
| Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
| Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |
Referencias
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).
- O’Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).
- Mitchell, B. G., Gardner, A. Mortality and Clostridium difficile infection: a review. Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).
- George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. Antimicrobial agent-induced diarrhea–a bacterial disease. J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).
- George, R. H., et al. Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis. Br Med J. 1 (6114), 695 (1978).
- Bartlett, J. G. Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease. Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).
- Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile–more difficult than ever. N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).
- Ünal, C. M., Steinert, M. Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections. Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).
- Kelly, C. P., et al. The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes. Gastroenterology. 150 (4), S122 (2016).
- Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review. Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).
- Hensbergen, P. J., et al. Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831. FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).
- Cafardi, V., et al. Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins. PLoS One. 8 (11), e81306 (2013).
- Hensbergen, P. J., et al. A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins. Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).
- Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile. Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).
- Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).
- Bergfors, T. Seeds to crystals. J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).
- Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. Jolly SAD. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- . . The PyMOL Molecular Graphics System. , (2002).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Wang, B. C. Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography. Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Zwart, P. H., et al. Automated structure solution with the PHENIX suite. Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).
- Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery – where are we heading next?. Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).
- Rubino, J. T., et al. Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile. J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).
- Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. His-tag impact on structure. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).
- Gasteiger, E., Walker, J. M., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors. Microb Cell Fact. 4, 34 (2005).
- Stura, E. A., Wilson, I. A. Applications of the streak seeding technique in protein crystallization. J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).
