In vitro differentiering af humane CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Induced Regulatory T-celler (iTregs) fra naive CD4 ^{+ T-celler} under anvendelse et TGF-β-holdige protokol

CD4 + CD25 + Foxp3 + regulatoriske T-celler (tregs) undertrykker andre immunceller og er kritiske formidlere af perifer tolerance, forhindrer autoimmunitet og overdreven inflammation ^1. Betydningen af ​​tregs er eksemplificeret ved den humane sygdom immunodysregulation polyendocrinopathy enteropati X-bundet syndrom (IPEX), hvori tab af tregs skyldes mutationer i den `master' Treg transkriptionsfaktor forkhead kasse P3 (Foxp3) fører til alvorlig systemisk autoimmun sygdom, dødbringende i en tidlig alder. Men tregs fungere som en tveægget sværd i immunsystemet som de også kan hæmme anti-tumor immunitet i visse indstillinger ^2. Terapeutisk manipulation af treg nummer og funktion er derfor underlagt talrige kliniske undersøgelser. I kræft, kan udtømning af tregs være ønskeligt og vis succes af kliniske tilgange tilskynder til yderligere forskning ^3. Ved autoimmune og inflammatoriske sygdomme, foruden terapeutiske virkninger af tregs i several mus sygdomsmodeller, de seneste første i-mand forsøg med adoptiv treg overførsel for at forhindre graft- versus -host sygdom (GvHD) ^{4 – 7} og til at vurdere sikkerheden i behandling af type 1-diabetes ⁸ viste meget lovende resultater.

Naturligt forekommende tregs (nTregs) omfatter thymiske-afledte tTregs og perifert inducerede pTregs, med ikke-redundante væsentlige funktioner i at bevare sundhed ^9-11. Men nTreg tal er begrænset, tilskynde til komplementære tilgang inducerende tregs (iTregs) in vitro fra naive T-celle forstadier ^12. Stadig stabilitet iTregs, formentlig på grund af manglende demethylering i den såkaldte Treg-specifik demethyleret region (TSDR) i Foxp3 gen locus ^13, er fortsat en bekymring, og flere undersøgelser viser, at in vivo-induceret tregs er mere stabile ^14.

Til dato fortsat Foxp3 den bedste protein marker for tregs men det er ikke absolut specifik Eftersom humane konventionelle CD4 + CD25- T-celler transient udtrykker mellemliggende niveauer af foxp3 ved aktivering ^15,16. Selv om der er gjort betydelige fremskridt med at belyse reguleringen af ​​foxp3 udtryk, stadig meget at blive opdaget med hensyn til induktion, stabilitet og funktion af foxp3 især i humane celler. Trods forskelle i forhold til nTregs, in vitro inducerede foxp3 + CD4 ^{+ T-celler} kan anvendes som et modelsystem til at studere molekylære mekanismer for Foxp3 induktion og som et udgangspunkt for at udvikle protokoller i fremtiden, som tillader generering af iTregs der er mere ligner i vivo genereret tregs, som kunne være gældende for adoptiv overførsel strategier i fremtiden.

Der er ingen `guld standard' protokol til at fremkalde menneskelige iTregs, og nuværende protokoller er blevet udviklet på baggrund af efterligne Treg-inducerende betingelser in vivo: interleukin 2 (IL-2) Og transformerende vækstfaktor β (TGF-β) signalering er afgørende for Foxp3 induktion in vivo ^17, og all-trans-retinsyre (ATRA) – som produceres in vivo ved tarmassocieret dendritceller – bruges ofte til at forbedre Foxp3 induktion in vitro ^{18 -. 21} Vi har udviklet yderligere menneskelige Treg-inducerende protokoller under anvendelse butyrat ^22, en gut mikrobiota-afledt kortkædede fedtsyre, der for nylig blev vist at forøge murine Treg induktion ^23,24. Vi har også for nylig etableret en ny protokol til generation af iTregs med overlegen undertrykkende funktion in vitro ved hjælp af en kombination af TGF-β, ATRA og rapamycin ^22, hvor sidstnævnte er en klinisk godkendt pattedyr mål for rapamycin (mTOR-hæmmer), der er kendt for at fremme foxp3 vedligeholdelse under human treg ekspansion ^25,26.

Denne metode beskriver reproducerbar ivitro dannelse af humane CD4 + Foxp3 + iTregs ud fra en række forskellige betingelser, og deres efterfølgende fænotypebestemmelse ved flowcytometri og kvantitativ revers transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR) for at afsløre protokol-specifikke mønstre af ekspression af foxp3 og andre Treg signatur molekyler sådanne som CD25, CTLA-4, EOS, samt undertrykkelse af IFN-γ og SATB1 ekspression ^22. De genererede cellepopulationer kan anvendes til funktionelle assays vedrørende suppressive aktivitet, eller for molekylære undersøgelser, enten vedrørende generelle Foxp3 regulatorer eller studere virkninger er specifikke for visse forbindelser, såsom butyrat eller rapamycin. Yderligere forståelse af molekylære mekanismer kørsel treg differentiering er yderst relevant for fremtidige terapeutiske tilgange i autoimmunitet eller kræft til specifikt retter sig mod molekyler involveret i treg generation og funktion.