जटिल सेल समुदाय स्थिर आइसोटोप ट्रेसिंग के प्रयोग के आधार पर छाँटे गए उप-जनसंख्या में मापने चयापचय के लिए एक विधि
Summary
This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.
Abstract
Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of “mock sorted” cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.
Introduction
उच्च जीवों अलग प्रकार की कोशिकाओं है कि और अधिक जटिल कार्यों के बारे में लाने के लिए सहयोग करने की जटिल समुदायों होते हैं। उदाहरण के लिए, ट्यूमर न केवल कैंसर कोशिकाओं, लेकिन यह भी fibroblasts, कोशिकाओं है कि रक्त वाहिकाओं का गठन, और अक्सर प्रतिरक्षा सेल पैठ 1 होते हैं; रक्त प्रतिरक्षा सेल उपप्रकार 2 के दर्जनों का एक जटिल मिश्रण होता है; और यहां तक कि सुसंस्कृत सेल लाइनों ऐसे ल्यूमिनल और स्तन कैंसर की कोशिकाओं 3 के बेसल उपप्रकार के रूप में कई उप-जनसंख्या, से मिलकर कर सकते। इसके अलावा, अलग सेल प्रकार है कि एक समय में होना चयापचय "सहयोग" प्रदर्शन कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, मस्तिष्क में, astrocytes लैक्टेट, जो तब न्यूरॉन्स कि इस सब्सट्रेट 4 oxidize के लिए "फेड" है ग्लूकोज में परिवर्तित करने के लिए लगा रहे हैं; टी lymphocytes कुछ संदर्भों सिस्टीन 5 का एक स्रोत के रूप में आसन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं पर निर्भर कर रहे हैं; और कैंसर कोशिकाओं एसोसिएट्स के साथ सहयोग कर सकते हैंट्यूमर 6 में ciated fibroblasts। इस तरह की व्यवस्था की चयापचय व्यवहार को समझने के लिए, यह अलग है और वर्तमान में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के चयापचय गतिविधियों को मापने के लिए आवश्यक है।
अब तक सेल प्रकार को अलग करने के लिए सबसे अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई है। इस विधि प्रदान की है कि सेल प्रकार या ब्याज की राज्य कर सकते हैं फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी, इंजीनियर फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति, या अन्य रंगों का उपयोग "लेबल" हो सकता है, मोटे तौर पर लागू है। एक विकल्प के लिए एक सेल सॉर्टर के माध्यम से शुरू में अलग कोशिकाओं प्रकार, फिर से संस्कृति अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं से प्राप्त करने के लिए है, और फिर इन संस्कृतियों 7 के चयापचय अध्ययन करते हैं। बहरहाल, यह केवल संभव है अगर सेल प्रकार या phenotype संस्कृति की स्थिति में स्थिर है, और इस तरह के सेल चक्र राज्यों, और न ही सह संस्कृतियों में चयापचय सहयोग के रूप में क्षणिक व्यवहार पर कब्जा नहीं कर सकते हैं। इस तरह के मामलों के लिए, चयापचय इतने पर सीधे मापा जाना चाहिएrted कोशिकाओं। इस के बाद से सेल छँटाई प्रक्रिया जोर दिया है कि उनके चयापचय 8 को विकृत कर सकता करने के लिए कोशिकाओं विषयों चुनौती दे रहा है, और हम केवल कुछ इस दृष्टिकोण 9, 10 लेने के अध्ययन के बारे में पता कर रहे हैं। विशेष रूप से, हमने पाया है कि इस तरह के अमीनो एसिड के रूप में प्रमुख चयापचयों सेल छँटाई बफर में रखा कोशिकाओं से रिसाव हो सकता है, ताकि पूर्ण मेटाबोलाइट बहुतायत के माप नहीं रह विश्वसनीय हैं 11 (हालांकि हल अंशों के बीच सापेक्ष तुलना में अभी भी मूल्यवान हो सकता है)।
इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, हम छँटाई करने से पहले स्थिर आइसोटोप के साथ कोशिकाओं लेबल, और सेलुलर चयापचयों, बजाय मेटाबोलाइट प्रचुरता में MIDs पर ध्यान केंद्रित। चूंकि MIDs लंबे समय के तराजू से अधिक का गठन कर रहे हैं, वे कम से छंटाई की स्थिति के लिए लघु अवधि के जोखिम से प्रभावित किया जाना चाहिए। हम पूर्ण स्कैन उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री है, जो काफी संवेदनशील दा प्रदान करने के लिए है का उपयोग कर MIDs योंटा चयापचयों के सैकड़ों चारों ओर 500,000 हल कोशिकाओं से शुरू, सेल छँटाई समय के बारे में 30-60 मिनट की आवश्यकता पर। एक के बीच एक तुलना सीधे "नकली क्रमबद्ध" नियंत्रण (कोशिकाओं किसी भी विशिष्ट आबादी gating बिना सेल सॉर्टर साधन के माध्यम से पारित कर दिया) और मेटाबोलाइट निकासी संस्कृति पकवान से सुनिश्चित करने के लिए कि मनाया MIDs मूल संस्कृति में उन लोगों के प्रतिनिधि हैं बना है। स्थिर आइसोटोप ट्रेसर की पसंद पर निर्भर करता है, विभिन्न चयापचय मार्ग इस विधि के साथ अध्ययन किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे विधि सिद्धांत है कि सेलुलर चयापचयों में MIDs एक सेल की चयापचय गतिविधियों के "इतिहास" को प्रतिबिंबित पर आधारित है। यह संभव कोशिकाओं के उप-जनसंख्या में चयापचय की गतिविधियों की जांच करने के लिए, के …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).
Materials
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree – MC – VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20×2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| MYRSYRA 99.5% OPTIMA (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5ml, 8-425 32×11.6mm,amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 LOCK SKRUV VITT PTFE PACKNING 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
Referencias
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