Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

Um dos principais desafios da saúde no século ²¹ são as doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA). Tau é uma proteína associada a microtúbulos que estimula a formação de microtúbulos (MT). Tau está igualmente envolvido em várias doenças neurodegenerativas, os chamados tauopatias, dos quais o mais conhecido é AD. Nestes distúrbios, Tau auto-agregados em filamentos helicoidais emparelhados (PHFs) e é encontrado modificado em muitos resíduos por modificações pós-translacionais (PTMS), tais como fosforilação ^1. A fosforilação da proteína tau está implicado tanto na regulação da sua função fisiológica de estabilização de MT e da perda da função patológica que caracteriza neurónios AD.

Além disso, a proteína Tau, quando integrado no PHF em neurónios doentes, é invariavelmente hiperfosforilada ^2. Ao contrário Tau normal que contém 2-3 grupos fosfato, o Tau hiperfosforilada em PHF contém 5-9 phosphate os grupos ^3. Hiperfosforilação de Tau corresponde tanto a um aumento da estequiometria em alguns locais e a fosforilação de sítios adicionais que são chamados locais de fosforilação patológicas. No entanto, existe sobreposição entre AD e padrões adultos normais de fosforilação, apesar das diferenças quantitativas no nível ^4. Como eventos de fosforilação função de influência e disfunção de Tau específica permanece em grande parte desconhecido. Nosso objetivo é decifrar regulação Tau por PTMs no nível molecular.

Para aprofundar a compreensão dos aspectos moleculares de Tau, temos de enfrentar os desafios técnicos. Em primeiro lugar, uma proteína tau é intrinsecamente desordenados (PDI), quando isolados em solução. Estas proteínas não têm estrutura tridimensional bem definida em condições fisiológicas e requerem determinados métodos biofísicos para estudar a sua função (s) e as propriedades estruturais. Tau é um paradigma para a crescente classe dos deslocados internos, muitas vezes encontrados associadospatologias como doenças neurodegenerativas, aumentando assim o interesse para compreender os parâmetros moleculares subjacentes suas funções. Em segundo lugar, a caracterização de Tau fosforilação é um desafio analítico, com 80 potenciais locais de fosforilação ao longo da sequência da tau isoforma mais longa 441 amino-ácido. Um certo número de anticorpos têm sido desenvolvidos contra epítopos de tau fosforilados e são utilizados para a detecção de tau patológica em neurónios ou tecido cerebral. eventos de fosforilação pode ter lugar em, pelo menos 20 locais visados ​​pelas cinases dirigidas-prolina, a maioria deles em estreita proximidade no interior da região rica em prolina. O qualitativa (que sites?) E caracterização quantitativa (o que estequiometria?) É difícil, mesmo pelas mais recentes técnicas de MS ^5.

espectroscopia de RMN pode ser utilizada para investigar as proteínas desordenados que são altamente dinâmicos sistemas constituídos por conjuntos de confórmeros. espectroscopia de RMN de alta resolução foi apliEd para investigar a estrutura e função da proteína tau. Além disso, a complexidade do perfil a fosforilação da tau, levou ao desenvolvimento de ferramentas moleculares e novos métodos de análise utilizando RMN para a identificação de sítios de fosforilação ^{6 – 8.} RMN como um método analítico permite a identificação de locais de fosforilação da tau de um modo global, a visualização de todas as modificações de sítio único numa única experiência, e a quantificação da extensão da incorporação de fosfato. Este ponto é essencial, pois embora os estudos de fosforilação sobre Tau abundam na literatura, a maioria deles têm sido realizados com anticorpos, deixando um grande grau de incerteza sobre o perfil completo de fosforilação e, assim, o verdadeiro impacto de eventos de fosforilação individuais. cinases recombinantes incluindo PKA, 3β glicogênio sintase-quinase (Gsk3β), ciclina dependente de quinase 2 / ciclina A (CDK2 / CycA), quinase ciclina-dependentes 5 (CDK5) / p25 actproteína ivator,-extracelular sinal-quinase regulada 2 (ERK2) e microtúbulos-quinase regula-afinidade (MARK), que apresentam uma actividade no sentido de fosforilação da tau, pode ser preparada numa forma activa. Além disso, os mutantes Tau que permitem a geração de isoformas da proteína tau específicas com padrões de fosforilação bem caracterizados são usadas para decifrar o código de fosforilação de tau. Espectroscopia de RMN é então usado para caracterizar amostras Tau enzimaticamente modificados ^{6 – 8.} Embora a fosforilação in vitro de tau é mais difícil do que o pseudo-fosforilação tal como por mutação da seleccionados Ser / Thr em resíduos de ácido glutâmico (Glu), esta abordagem tem as suas vantagens. De facto, nem os parâmetros de impacto nem interacção estruturais de fosforilação pode sempre ser mimetizado por ácidos glutâmicos. Um exemplo é o motivo por sua vez observada em torno fosfoserina 202 (pSer202) / fosfotreonina 205 (pThr205), que não é reproduzida com Glu mutações ^9.

<p class = "jove_content"> Aqui, a preparação de Tau marcado isotopicamente para investigações de RMN serão descritos em primeiro lugar. proteína tau fosforilada por ERK2 é modificado em vários sites descritos como locais patológicos de fosforilação, e, portanto, representa um interessante modelo de Tau hiperfosforilada. Um protocolo detalhado de Tau na fosforilação in vitro pela quinase ERK-2 recombinante é apresentada. ERK2 é activada por fosforilação de proteína quinase activada mitogénio / ERK-cinase (MEK) ^10-12. Além disso para a preparação de proteína Tau modificado, marcado isotopicamente, a estratégia de RMN utilizado para a identificação do PTMs é descrito.