기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음
Summary
Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.
Abstract
Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.
Introduction
형광 현미경 긴 제브라 피쉬 CNS의 유전자 개발 한에 특히 그 효과의 영향을 연구하기 위해 사용되었다. 고해상도 현미경 뇌 발달, 근육 생성, 많은 개발이 이벤트와 관련된 세포 과정의 상세한 매핑을 허용했다. 개별 세포의 죽음을 공부하는 것은 주로 표준 이미징 과정에서 선택적 세포 사멸을 유도하는 기술적 인 문제로, 더 도전하고있다. 그러나, 단일 셀 해상도 이미지 및 높은 타겟 절제 기술의 조합은 필연적 세포 – 세포 상호 작용뿐만 아니라 스트레스와 손상을 즉시 세포 반응의 조사를 허용한다. 이러한 과정을 이해하는 것은 특히 뉴런 – 아교 세포 상호 작용의 진행에 기여하는 것으로 나타났다 운동 신경 질환 (MND), 신경 퇴행성 질환, 중요질병 (3).
국방부, 또는 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)는 뇌간, 운동 피질과 척수의 운동 신경에 영향을 미치는 치명적인 신경 퇴행성 질환이다. 이러한 신경 세포의 손실은 근육 손실을 초래하고, 환자는 3에서 죽을 – 진단 4 5 년. 근육 섬유에 척수 링크에서 운동 신경 및 근육 수축을 촉진에 필수적인 역할을한다. 이러한 뉴런이 통신 또는 사망의 실패는 점차적으로 근육을 약하게하고, 제비 도보, 말과 호흡 할 수있는 환자의 능력에 영향을 미친다. 살아있는 동물의 운동 신경 및 단기 결과의 죽음을 떠올리 더 나은 정상 세포 항상성과 질병에 관련된 동적 프로세스를 이해할 수있는 좋은 기회를 제공합니다.
제브라 피쉬는 신경 퇴행성 질환 (1)을 연구하는 매력적인 모델 시스템으로 등장했다. 이그러한 체외 수정, 짧은 발전 시간 신경계 광학 접속, 형질 전환의 용이함,이 모델 생물에 의해 제공되는 장점에 기인한다. 또한, 용이하게 복합 형질 전환 지브라 피쉬를 생성 할 수있는 능력은 다른 세포 유형의 다수의 표지 전략을 허용한다. 유전 적 절제는 특정 세포 유형이 아니라 광범위한 장애를 허용하지만 개별 셀 (5)을 대상으로의 미세 제어가 부족 죽일 접근한다. 레이저를 이용한 기술은, 다른 한편으로는, 미세한 공간적 제어를 제공하는 다른 동물 모델에 사용 하였다. 반면 같은 가장 접근 사용 특화된 기기, 레이저, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 이광자 셋업 펄스를 13연구 그룹은 최근 종래의 공 초점 현미경 (14)의 UV 레이저의 장점을 가지고있다.
여기에 설명 된 기술은 선택된 운동 뉴런에서 용량 의존적 방식으로 세포 스트레스 또는 사망을 일으킬 수있는 UV 레이저 매개 방식으로 고해상도의 공 초점 현미경을 결합한다. 또한, 세포 배양에 살아있는 동물에서 성공적으로 테스트되었습니다 일반적으로 설치 405 나노 레이저의 사용에 의존, 이러한 신경 세포의 죽음 이후 소교 통관 등의 세포 상호 작용의 세부 특성을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
레이저 절제의 접근 방법
레이저를 이용한 제거 기술은 세포의 개인 또는 소규모 그룹의 정확한 타겟팅을 할 수 있습니다. 고해상도 현미경 및 제브라 피쉬와 같은 동물 모델에서 유전자 조작과이 기술을 결합하면 연구자들이 체계적으로 개별 세포의 운명 부상 후 상호 작용을 연구 할 수 있습니다.
여기에 설명 된 UV (405 ㎚), 레이저 어블 레이션 프로토콜은 개별 세포 스트레스 또는 사망을 선택적 (용량 의존적 방식으로), 뉴런, 신경교 이웃 동안 및 축색 무사 방치 할 수있는 방법을 설명합니다. 우리는 성공적 세포 배양 실험에서이 방법을 이용하고 여기 제브라 척수에 대한 구체적인 방법을 기술하고있다. 우리는 선택적으로 다른 셀 (도 5를 참조하면, 그리고 네트워크 내에서 각각의 뉴런을 강조하여 제브라 척수이 방법의 구현을 보여준다 <strong> B), 또는 즉시 회복하지 않고 단일 신경 세포를 죽이는하여 (그림 5, C 및 D).
이전에, 이러한 질소 펄스 레이저 또는 이광자 레이저 시스템과 같이 전문 레이저 시스템은, 조직 손상 및 모터 신경 transections 10, 11, 12, 13을 유도하기 위해 요구되었다. 이 레이저 시스템은 성공적으로 동맥과 정맥 6 혈전증, 급성 신부전 (7), 심장 손상 8과 같은 세포 손상을 야기하고, 칼슘 파도 뇌 손상 9 후 소교 반응을 연구하는데 이용되고있다. 또한, Soustelle 연구팀은 초파리 (14) <상피의 손상과 신경 교세포를 유도하기 위해 기존의 공 초점 설정 (351 나노 미터와 364 nm의 UV 레이저를) 사용/ SUP>.
ALS를 이해하기위한 Zebrafish의 모델의 관련성 (및 기타 인간의 질병)
제브라 특히 개발 연구 28, 29, 30, 널리 사용되는 모델 생물이다. 그들이 어떤 한계를 가지고 있지만, 인간의 질병을 모델링하고 병원성 분자 메커니즘의 이해를 제공하기 위해 자신의 잠재력은 엄청나 다. 제브라 피쉬 모델 MND 연구를위한 잘 확립 된 중요한 통계 분자량 31, 32, 33, 34을 이끌어왔다. 형질 전환 제브라 피쉬 라인을 빠르게 생성 할 수있다 (4 – 5 개월) 및 특정 세포 유형, 그들 ALS의 현재 동물 모델에 귀중한 추가 할 기능의 선택적 추적을 할 수 있습니다. 제브라 피쉬 배아 / 애벌레는 광학적으로 투명하고 독특한 체험관을 제공뇌 또는 용이 설치류 모델에서 달성 (또는 인간) 될 수 척수에서 단일 세포 수준에서 장기간 실시간 이미징을 허용 정신 장점. 이러한 단일 셀 어블 분자 기법과 함께 사용하면,이 생체 내에서 정확한 분자 메커니즘을 연구하는 실험 고유 플랫폼을 제공한다.
모터 뉴런은 선택적 UV 레이저 어블 레이션을 사용하여 타겟팅 할 수 있습니다
제브라 피쉬의 척수 신경 세포는 출생 후 10 시간 이내에 개발을 시작 후 약 48 시간 (35), (36) 설정됩니다. 이 급속한 발전은 짧은 시간 프레임과 높은 처리량이 신경 세포의 시각화 할 수 있습니다. 운동 뉴런은 ALS에서, 운동 피질 (상위 운동 뉴런), 뇌간, 척수 (하위 운동 뉴런)에 영향을받는 뇌와 근육 사이에 필수적인 링크를 제공. 이러한 신경 세포의 손실은 불가피 무에 이르게scle 위축과 약점. 제브라 피쉬의 척수의 운동 신경은 별개의 돌기에 의해 -3MNX1 같은 모터 신경 세포 특이 적 프로모터의 사용으로 식별 할 수 있습니다. 이러한 돌출 된 신경 세포의 세포 소마를 타겟팅하는 시간 (그림 4 및 비디오 1)를 통해 축삭 돌기를 따라 선행 성 변성를 한 것으로 밝혀졌습니다. 척추 운동 뉴런의 단일 셀 해상도의 영상은 추가로 레이저 어블 레이션 (그림 4 참조 (27)의 보조 비디오 3 참조) 후 포스파티딜 세린의 전위 및 그에 따른 넥신 V-라벨을 확인했다. 우리는 우리의 UV 레이저 어블 레이션 방법 후 뉴런을 죽음에 넥신 V의 활성화를보고 있지만이 가속화 과정에서 발생되는 죽음의 폭포가 정확하게 신경 퇴행 또는 정상 세포 항상성 동안 발생하는 신경 세포의 죽음과 일치하는지, 우리는 확신 할 수 없습니다.
이 박리 방법은 재현성이 높은 반면특정 다른 매립 전략은 또한 UV 어블 레이션의 효율에 영향을 미칠 수있다. 우리의 경험에서, 우리는 우리의 생선 내장 아가 층을 최소화하기위한 가장 성공적이었다. 의한 감쇠가 발생 산란 효과가 궁극적으로 세포에 의해 수신 된 UV 전력을 감소시킬 수있다 계란 추가의 물 층 중간 매립 두꺼운 층 빔 경로.
향후 다른 형질 전환 어류 라인의 교차점은 레이저 – 유도 된 세포 파괴 등 신경교 다른 영향 세포의 반응 (12 시간까지) 즉각적이고 단기간의 시각화를 허용 할 것이다. 예를 들어, ALS 같은 신경 퇴행성 질환에서 성상 세포와 비 세포 자치 독성 연구 스포트 라이트에왔다 무겁게 산발적 인 및 가족 ALS (37), (38)의 병원성에 연루되어있다. 그러나 메커니즘 폐해 독성 및 선택성을 기초모터쪽으로 신경 불분명 남아 있습니다. 우리와 다른 사람은 최근 미세 아교 세포가 신경 세포를 죽음의 말림을 연구하기 위해이 방법을 이용했다 및 신경 세포의 잔재 (27), (39), (40)의 간격을 시각화.
고해상도 현미경 신경 염증 마커와 박리 기술을 결합하여 미래의 연구자들은 단일 세포의 기능 및 상호 전지 시스템의 이해를 확장하는 것을 허용 할 것이다. 생체 내 환경에서 이러한 프로세스의 특성 발달 설정에서뿐만 아니라 세포의 상호 작용이 3 손상 될 수 MND, (41)를 포함하는 신경 퇴행성 질환의 모델뿐만 아니라 중요합니다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the MND Research Institute of Australia and the Cure for MND Foundation [GIA 1638], the Snow Foundation, and Macquarie University [MQRDG 9201401462]. Imaging was carried out at the Microscopy Facility in the Department of Biomedical Sciences, Macquarie University. Other members of the MND research center are thanked for their contributions to the development of these methods and fish lines.
Materials
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8-1.5% | |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass | World Precision Instruments, Inc. | GC100F-10 (short) GC100F-15 (long) |
Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Egg water | 0.6 g Instant Ocean sea salt, 4ml of 1mg/ml methylene blue in 10 l deionized water | ||
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Heat block | Select BioProducts | Digital block heater (SBD110_) | |
| Microinjection apparatus | World Precision Instruments, Inc. | Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation) | |
| Stereoscope | Leica | Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica) | |
| Microscope | Leica | SP5 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Referencias
- Becker, T. S., Rinkwitz, S. Zebrafish as a genomics model for human neurological and polygenic disorders. Dev Neurobiol. 72 (3), 415-428 (2012).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annu Rev Neurosci. 32, 435-506 (2009).
- Philips, T., Robberecht, W. Neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis: role of glial activation in motor neuron disease. Lancet Neurol. 10 (3), 253-263 (2011).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nat Rev Neurosci. 14 (4), 248-264 (2013).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
- Jagadeeswaran, P., Paris, R., Rao, P. Laser-induced thrombosis in zebrafish larvae: a novel genetic screening method for thrombosis. Methods Mol Med. 129, 187-195 (2006).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845 (2011).
- Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Dev Cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Lewis, G. M., Kucenas, S. Motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish. J Vis Exp. (76), (2013).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
- Villegas, R., et al. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Dev. 7, 19 (2012).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Soustelle, L., Aigouy, B., Asensio, M. L., Giangrande, A. UV laser mediated cell selective destruction by confocal microscopy. Neural Dev. 3, 11 (2008).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).Vol.4th ed. , (2000).
- Clark, K. J., Urban, M. D., Skuster, K. J., Ekker, S. C. Transgenic zebrafish using transposable elements. Methods Cell Biol. 104, 137-149 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365 (1), 290-302 (2012).
- Flanagan-Steet, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132 (20), 4471-4481 (2005).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front. Cell. Neurosci. , (2015).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish — emergence of a new model vertebrate. Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Lele, Z., Krone, P. H. The zebrafish as a model system in developmental, toxicological and transgenic research. Biotechnol Adv. 14 (1), 57-72 (1996).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Kabashi, E., et al. Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo. Hum Mol Genet. 19 (4), 671-683 (2010).
- Laird, A. S., et al. Progranulin is neurotrophic in vivo and protects against a mutant TDP-43 induced axonopathy. PLoS One. 5 (10), 13368 (2010).
- Lemmens, R., et al. Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish. Hum Mol Genet. 16 (19), 2359-2365 (2007).
- Ramesh, T., et al. A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease. Dis Model Mech. 3 (9-10), 652-662 (2010).
- Hanneman, E., Trevarrow, B., Metcalfe, W. K., Kimmel, C. B., Westerfield, M. Segmental pattern of development of the hindbrain and spinal cord of the zebrafish embryo. Development. 103 (1), 49-58 (1988).
- Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Prog Neurobiol. 69 (6), 419-449 (2003).
- Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
- Philips, T., Rothstein, J. D. Glial cells in amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol. 262, 111-120 (2014).
- Mazaheri, F., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nat Commun. 5, 4046 (2014).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22 (9), 830-836 (2012).
- Radford, R. A., et al. The established and emerging roles of astrocytes and microglia in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Front Cell Neurosci. 9, 414 (2015).
