Co-localización de los marcadores de linaje de la célula y la señal de tomate
Summary
Hemos desarrollado dos conjuntos de rastreo de combinaciones en Rosa26 tdtomato (ubicuamente expresado en todas las células) / Cre (expresa específicamente en condrocitos) ratones: uno con 2.3Col1a1-GFP (específico para los osteoblastos) y uno con inmunofluorescencia (específico de células óseas). Los datos demuestran la transformación directa de los condrocitos en las células óseas.
Abstract
El sistema de rastreo de linaje de células se ha utilizado predominantemente en los estudios de biología del desarrollo. El uso de la recombinasa Cre permite la activación del reportero en una línea celular específica y toda la progenie. En este caso, se utilizó la línea celular de rastreo técnica para demostrar que los condrocitos se transforman directamente en los osteoblastos y los osteocitos durante hueso largo y el desarrollo cóndilo mandibular utilizando dos tipos de Cre, Col10a1-Cre y Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), cruzamos con Rosa26 tdTomato. Tanto Col10 y agrecano son marcadores bien reconocidos por los condrocitos.
Sobre esta base, hemos desarrollado un nuevo linaje de células método de seguimiento en relación con el destino de células inmunohistoquímica para definir fluorescente mediante el análisis de la expresión de marcadores de células específicas. Runx2 (un marcador de células osteogénicas en fase inicial) y la dentina protein1 matriz (DMP1, un marcador para las células de la última etapa osteogénicas) eranse utiliza para identificar las células óseas de condrocitos derivados y su estado de diferenciación. Esta combinación no sólo amplía la aplicación de rastreo de linaje de células, sino que también simplifica la generación de ratones compuestos. Más importante aún, los estados de número, ubicación, y la diferenciación de la progenie celular parental se muestran simultáneamente, proporcionando más información de la línea celular de rastreo solo. En conclusión, la co-aplicación de técnicas de trazado de linaje celular y de inmunofluorescencia es una herramienta poderosa para la investigación de biología celular in vivo.
Introduction
Durante el desarrollo, la formación de hueso endocondral representa más del 80% del volumen esquelético. Se cree ampliamente que comienza con la apoptosis de los condrocitos hipertróficos. Posteriormente, las células de la médula ósea subyacente invaden y iniciar la angiogénesis, seguido por la deposición de hueso nuevo por marrow- ósea y células derivadas de periostio 1,2. El destino celular de condrocitos hipertróficos (HC), sin embargo, ha sido un tema de debate durante décadas 3. Inicialmente, los HC se considera que el final de la vía de diferenciación de condrocitos, y la apoptosis en general se piensa que es el destino final de los HC. Ahora, algunos investigadores sugieren que al menos algunos HC podrían sobrevivir y contribuir a la formación de hueso endocondral. A pesar de que propusieron que el crecimiento de condrocitos placa tenían la capacidad de transdifferentiate en osteoblastos sobre la base de ultraestructura, tinción inmunohistoquímica, y los estudios in vitro de 46 años, ninguno de estos métodos were definitiva para demostrar la contribución de los condrocitos al linaje de osteoblastos.
La técnica de rastreo de linaje celular proporciona una manera más rigurosa para estudiar el destino celular. En pocas palabras, una enzima recombinasa, que sólo se expresa en un tipo específico de célula, estimula la expresión del gen reportero. De esta manera, este tipo de células y sus descendientes son etiquetados de forma permanente 7. El sistema Cre-loxP se utiliza comúnmente en el rastreo de linaje. Cre (la enzima recombinasa) será escindir la secuencia de parada entre los dos sitios loxP y activar el reportero en una línea celular específica (Figura 1A). En algunos casos, el investigador puede elegir un punto de tiempo favorable para activar Cre mediante el uso de un fármaco, tal como tamoxifeno, causando Cre para fusionar a una forma modificada del receptor de estrógeno (Cre ERT2) 8. reporteros fluorescentes han convertido en el estándar en el linaje de rastreo experimentos, ya que reducen drásticamente la complejidady mejorar la precisión y la eficiencia de la celda destino de rastreo 8,9. tdTomato se está convirtiendo en la mejor elección entre los reporteros fluorescentes ya que tiene la proteína fluorescente más brillante y la más fuerte de epifluorescencia, lo que es fácilmente visualizada 7 (Figura 1A).
Al utilizar el linaje Rosa26 tdTomato sistema de rastreo, nuestro grupo y otros investigadores han demostrado que los HC puede cambiar su fenotipo en células óseas durante el desarrollo 10-14. Para lograr esto, hemos desarrollado dos conjuntos de rastreo de combinaciones con Rosa26 tdtomato (expresión ubicua en todas las células) / Cre (específico de condrocitos) ratones: 2.3Col1a1-GFP (específico de osteoblastos) e inmunofluorescencia (específico de células óseas). Los datos demuestran que ambos métodos son formas viables para estudiar el destino de células in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido a las limitaciones tecnológicas, siempre es difícil de investigar el comportamiento de las células in vivo. Sin embargo, la técnica de rastreo de linaje celular está demostrando ser una herramienta poderosa para el estudio de la biología celular 7-9. En este estudio, podemos mejorar aún más este protocolo mediante la combinación con inmunofluorescencia. De esta manera, el destino celular puede ser definido por múltiples marcadores relacionados, que amplía la aplicación de rastreo d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
Referencias
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?. Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?. Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
