Co-localizzazione di marcatori di cellule lignaggio e il segnale di pomodoro
Summary
Abbiamo sviluppato due serie di tracciare combinazioni a Rosa26 tdtomato (ubiquitariamente espresso in tutte le cellule) / Cre (specificamente indicato nella condrociti) topi: uno con 2.3Col1a1-GFP (specifico per osteoblasti) e uno con immunofluorescenza (specifico per le cellule ossee). I dati dimostrano la trasformazione diretta di condrociti in cellule ossee.
Abstract
Il sistema di tracciamento linea cellulare è stata utilizzata prevalentemente negli studi di biologia dello sviluppo. L'uso di Cre ricombinasi consente l'attivazione del reporter in una linea cellulare specifica e tutto progenie. Qui, abbiamo utilizzato la linea cellulare tecnica tracing per dimostrare che condrociti trasformano direttamente in osteoblasti e osteociti durante osso lungo e lo sviluppo del condilo mandibolare utilizzando due tipi di Cre, Col10a1-Cre e Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), incrociati con Rosa26 tdTomato. Sia Col10 e aggrecan sono marcatori ben riconosciuti per condrociti.
Su questa base, abbiamo sviluppato un nuovo metodo di lignaggio cellule tracing in combinazione con fluorescenti immunoistochimica-per definire il destino della cellula, analizzando l'espressione di marcatori cellulari specifici. Runx2 (un marker per le cellule osteogeniche fase iniziale) e dentina matrice protein1 (DMP1, un marker per le cellule in fase avanzata osteogeniche) eranoutilizzato per identificare le cellule ossee chondrocyte-derivati e il loro stato di differenziazione. Questa combinazione non solo amplia l'applicazione della linea cellulare tracing, ma semplifica anche la generazione di topi composti. Ancora più importante, gli stati posizione, il numero e la differenziazione delle progenie cellula madre vengono visualizzati contemporaneamente, fornendo più informazioni rispetto linea cellulare tracciamento solo. In conclusione, la co-applicazione di tecniche tracing linea cellulare e immunofluorescenza è un potente strumento per studiare biologia cellulare in vivo.
Introduction
Durante lo sviluppo, rappresenta la formazione di osso endochondral per oltre l'80% del volume scheletrico. E 'opinione diffusa che inizia con l'apoptosi dei condrociti ipertrofici. Successivamente, le cellule dal midollo osseo sottostante invadono e avviare l'angiogenesi, seguita dalla deposizione di nuovo tessuto osseo da dal midollo osseo e cellule del periostio di derivazione 1,2. Il destino delle cellule di condrociti ipertrofici (HC), tuttavia, è stato un problema di dibattito per decenni 3. Inizialmente, HC sono stati considerati alla fine del percorso di differenziazione dei condrociti, e l'apoptosi è stato generalmente pensato per essere il destino finale di HC. Ora, alcuni ricercatori suggeriscono che almeno alcuni HC potrebbero sopravvivere e contribuire alla formazione di osso endochondral. Anche se hanno proposto che la crescita condrociti piatto aveva la capacità di transdifferenziare in osteoblasti sulla base di ultrastruttura, colorazione immunoistochimica, e studi in vitro 46, nessuno di questi metodi were definitiva a dimostrare il contributo di condrociti alla stirpe degli osteoblasti.
La tecnica di linea cellulare tracciare fornisce un modo più rigoroso per studiare il destino della cellula. Per dirla in breve, un enzima ricombinasi, che viene espresso solo in un tipo specifico di cellula, stimola l'espressione del gene reporter. In questo modo, questo tipo di cellula e loro discendenti sono permanentemente etichettati 7. Il sistema Cre-loxP è comunemente usato in lineage tracing. Cre (l'enzima ricombinasi) sarà asportare la sequenza di STOP tra i due siti loxP e attivare il reporter di una determinata linea cellulare (Figura 1A). In alcuni casi, il ricercatore può scegliere un punto tempo favorevole per attivare Cre utilizzando un farmaco, come il tamoxifene, causando Cre di fondere ad una forma modificata del recettore dell'estrogeno (Cre ERT2) 8. giornalisti fluorescenti sono diventati lo standard in lignaggio tracciare esperimenti perché riducono drasticamente la complessitàe migliorare la precisione e l'efficienza del destino delle cellule tracciamento 8,9. tdTomato sta diventando la scelta migliore tra i reporter fluorescenti poiché ha la proteina fluorescente chiaro e il epifluorescenza forte, che lo rende facilmente visualizzato 7 (Figura 1A).
Usando il lignaggio Rosa26 tdTomato sistema di rintracciamento, il nostro gruppo e altri ricercatori hanno dimostrato che l'HC può cambiare il loro fenotipo in cellule ossee durante lo sviluppo 10-14. Per fare questo, abbiamo sviluppato due serie di tracciare combinazioni con Rosa26 tdtomato (espressione ubiquitaria in tutte le cellule) / Cre (specifico per condrociti) topo: 2.3Col1a1-GFP (specifico per osteoblasti) e immunofluorescenza (specifico per le cellule ossee). I dati dimostrano che i due metodi sono modi vitali per studiare il destino della cellula in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A causa di limitazioni tecnologiche, è sempre difficile studiare il comportamento delle cellule in vivo. Tuttavia, la tecnica linea cellulare tracciamento sta dimostrando di essere un potente strumento per lo studio della biologia delle cellule 7-9. In questo studio, abbiamo migliorare ulteriormente questo protocollo attraverso la combinazione con immunofluorescenza. In questo modo, il destino della cellula può essere definita da più marcatori correlate, che estende l'applicazione di lineage t…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
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