Summary

Co-localisation des marqueurs de cellules de la lignée et le signal de tomate

Published: December 28, 2016
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Summary

Nous avons développé deux ensembles de traçage des combinaisons dans Rosa26 tdTomato (ubiquitaire exprimé dans toutes les cellules) / Cre (spécifiquement exprimé dans les chondrocytes) souris: une avec 2.3Col1a1-GFP (spécifique à ostéoblastes) et une avec immunofluorescence (spécifique aux cellules osseuses). Les données démontrent la transformation directe des chondrocytes dans les cellules osseuses.

Abstract

Le système de traçage de la lignée cellulaire a été utilisé principalement dans les études de biologie du développement. L'utilisation de la recombinase Cre permet l'activation du rapporteur dans une lignée cellulaire spécifique et toute la descendance. Ici, nous avons utilisé la lignée cellulaire de traçage technique pour démontrer que les chondrocytes transforment directement en ostéoblastes et ostéocytes pendant os long et le développement de condyle mandibulaire en utilisant deux types de Cre, Col10a1-Cre et Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), traversé avec Rosa26 tdTomato. Les deux col10 et aggrécane sont des marqueurs bien reconnus pour chondrocytes.

Sur cette base, nous avons développé une nouvelle lignée méthode cellules traçage en conjonction avec fluorescent cellule sort immunohistochimie à définir en analysant l'expression de marqueurs cellulaires spécifiques. Runx2 (un marqueur pour les cellules ostéogéniques stade précoce) et la dentine matrice protein1 (DMP1; un marqueur pour les cellules ostéogéniques en fin de ligne) étaientutilisé pour identifier les cellules osseuses chondrocytes dérivés et leur état de différenciation. Cette combinaison non seulement élargit l'application de la lignée cellulaire traçage, mais simplifie également la génération de souris composés. Plus important encore, les statuts nombre, l'emplacement et la différenciation des descendants de la cellule mère sont affichées simultanément, fournissant plus d'informations que la lignée cellulaire de traçage seul. En conclusion, la co-application de la lignée cellulaire techniques de traçage et immunofluorescence est un outil puissant pour étudier la biologie des cellules in vivo.

Introduction

Pendant le développement, la formation osseuse endochondrale représente plus de 80% du volume du squelette. Il est largement admis qu'il commence par l'apoptose des chondrocytes hypertrophiques. Ensuite, les cellules de la moelle osseuse sous – jacente envahir et d' initier une angiogenèse, suivie par le dépôt osseux nouveau par marrow- osseuse et les cellules dérivées de 1,2 périoste. Le destin cellulaire de chondrocytes hypertrophiques (HCS), cependant, a été un sujet de débat depuis des décennies 3. Dans un premier temps, CAH ont été considérés comme la fin de la voie de la différenciation des chondrocytes, et l'apoptose a été généralement considérées comme le sort ultime de CAH. Maintenant, certains chercheurs suggèrent qu'au moins certains CAH pourraient survivre et contribuer à la formation d'os endochondral. Bien qu'ils ont proposé que la croissance des chondrocytes de la plaque avaient la capacité de transdifférencier en ostéoblastes basé sur ultrastructure, la coloration immunohistochimique, et des études in vitro 46, aucune de ces méthodes wERE définitive à démontrer la contribution des chondrocytes à la lignée des ostéoblastes.

La technique lignée cellulaire de traçage fournit une manière plus rigoureuse pour étudier le destin des cellules. Brièvement parlant, une enzyme recombinase, ce qui est exprimé uniquement dans un type particulier de cellules, stimule l'expression du gène rapporteur. De cette façon, ce type de cellule et leurs descendants sont marqués de façon permanente 7. Le système Cre-loxP est couramment utilisé dans la lignée de traçage. Cre (l'enzyme recombinase) excise la séquence d'arrêt entre les deux sites loxP et activer le rapporteur dans une lignée cellulaire spécifique (figure 1A). Dans certains cas, l'enquêteur peut choisir un point de temps favorable pour activer Cre en utilisant un médicament, comme le tamoxifène, causant Cre à fusionner à une forme modifiée du récepteur des oestrogènes (Cre ERT2) 8. reporters fluorescents sont devenus la norme dans la lignée de traçage des expériences, car ils réduisent considérablement la complexitéet d' améliorer la précision et l' efficacité du destin cellulaire traçage 8,9. tdTomato devient le meilleur choix parmi les reporters fluorescents , car il a la plus brillante protéine fluorescente et l'épifluorescence plus forte, ce qui rend facilement visualisées 7 (figure 1A).

En utilisant la lignée Rosa26 tdTomato système de traçage, notre groupe et d' autres chercheurs ont montré que CAH peut changer leur phénotype des cellules osseuses au cours du développement 10-14. Pour ce faire , nous avons développé deux ensembles de traçage des combinaisons avec Rosa26 tdTomato (expression omniprésente dans toutes les cellules) / Cre (spécifique à chondrocytes) souris: 2.3Col1a1-GFP (spécifique à ostéoblastes) et immunofluorescence (spécifique aux cellules osseuses). Les données démontrent que les deux méthodes sont des moyens viables pour étudier le destin des cellules in vivo.

Protocol

Tous les protocoles ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) au Texas A & M University College of Dentistry. Elevage 1. Animal Utiliser trois modèles animaux dans cette étude. Pour enquêter sur le sort des chondrocytes embryonnaires dans la formation de condyle, la première utilisation Col10a1-Cre 15 souris et les croiser avec Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROS…

Representative Results

Chondrocytes Transform directement dans les cellules osseuses (ostéoblastes et ostéocytes) dans le mandibulaire condyle et Long Bone. Aggrécane, un gène essentiel pour la chondrogenèse, est principalement exprimé dans les chondrocytes matures précoces et 18. Par conséquent, l'injection de tamoxifène à 2 semaines d'âge dans Agg ERT2-Cre;</em…

Discussion

En raison des limites technologiques, il est toujours difficile d'enquêter sur le comportement des cellules in vivo. Cependant, la technique lignée cellulaire de traçage se révèle être un outil puissant pour étudier la biologie des cellules 7-9. Dans cette étude, nous améliorons encore ce protocole en le combinant avec immunofluorescence. De cette façon, le destin des cellules peut être défini par plusieurs marqueurs associés, ce qui élargit l'application de la lignée de traça…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.

Materials

Tamoxifen  Sigma T5648 activate the Cre event 
Paraformaldehyde Sigma  P6148 fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid Alfa Aesar A10713 decalcify the hard tissue
Sucrose  Sigma S0389 dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes  Sigma H4272 retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin Sigma  A3059 blocking solution 
primary antibody for Runx2  Cell Signal D1L7F primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1 provided by Dr. Chunlin Qin primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG Sigma 18140 control for immunochemical staining
secondary antibody  Invitrogen A11008 second antibody for immunochemical staining
OCT Tissue-Tek 4583 embed the sample for frozen section
Tween 20 Fisher Scientific BP337 PBST
non-fluorescing antifade mountant Life technologies P36934 mounting slides
DAPI Life technologies P36931 nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories circle the section on the slide for for immunochemical staining 
Xylazine AnaSed anesthetization 
Ketaset  Zoetis anesthetization 
cryosection machine Leica CM1860 UV
confocal microscope Leica DM6000 CFS 

Referencias

  1. Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
  2. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  3. Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
  4. Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
  5. Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
  6. Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
  7. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
  8. Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
  9. Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
  10. Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
  11. Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
  12. Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
  13. Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
  14. Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
  15. Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
  16. Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
  17. Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
  18. Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
  19. Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
  20. Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?. Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
  21. Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?. Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
  22. Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
  23. Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
  24. Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
  25. Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
  26. Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
  27. Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  28. Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
  29. Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).

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Jing, Y., Hinton, R. J., Chan, K. S., Feng, J. Q. Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal. J. Vis. Exp. (118), e54982, doi:10.3791/54982 (2016).

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