We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.
The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.
골격 이온 항상성에 걸쳐 운동에서 다양한 기능을 갖는 고도로 복잡 동적 복잡한 기관이다. 뼈와 연골의 구성, 골격은, 구조 생화학 적 및 기계적 무결성 1의 유지 운영 기능적으로 서로 다른 세포 집단으로 구성되어 있습니다. 골격의 주요 기능 중 하나는 발전 및 성장의 역할이다. 이러한 프로세스는 꽉 내분비 및 유전 적 제어를 통해 규제하는 여러 세포 인구의 오케스트레이션을 필요로한다.
평탄 뼈 예 견갑골, 두개골 및 흉골 제외한 포유류 골격 연골 내 골화으로 알려진 과정을 통해 형성된다. 조절 분자 둘 공간적이 프로세스는, 중배엽이 주로 유래 중간 엽 세포의 축합으로 시작한다. 전사 인자의 SOX9의 영향으로, 세포 일에응축의 전자 내부 표현 및 유형 II 콜라겐과 aggrecan과 같은 연골 특정 세포 외 기질 (ECM) 성분을 분비, 연골 세포로 분화. 응축의 마진에서 세포는 미래의 뼈 3 서술, I 콜라겐과 연골막을 형성 유형을 표현한다. 나중에, 연골막의 osteoprogenitors는 전사 인자, Runx2와 osterix 4의 발현 감독, 조골 세포로 분화. 이 조골 세포의 우위로 연결이 층은 뼈의 중간 부분 주변의 광물 뼈 고리를 형성하는 골막을 이름이 변경됩니다. 연골 지지체의 골막과 침략의 혈관 침투, 그것으로 데려 haematopoetically 연골 세포 잔해와 연골 매트릭스 (5)의 많은 부분을 재 흡수 뼈 재 흡수 세포, 파골 세포를 유도 발생합니다. 형성된 공간은 일차 골화에 야기한 osteoprogenitors 의해 채워진다점진적으로 골간의 핵심을 차지하고 골막와 합병 센터. 기타 세포는 골수 일으킨다. 출생 주변 혈관 osteoprogenitors 이차 골화 중심을 형성하는 현상 골간의 양측 (골단)에서 다양한 연골 매트릭스를 관통. 골단 성장판 – – 모든 긴 뼈 (6)의 선형 성장을 조정하는 책임이있는 긴 뼈의 양쪽 끝에서 골단과 골간 사이에 위치한 연골의 밴드이다.
성장판에서 연골 세포는 처음 증식 및 이후 전사 및 성장 인자의 연속 식으로 조정 형태 학적으로 서로 다른 영역을 통해 진행. 이러한 일련의 이벤트의 절정이 연골 전구체의 중심 연골 세포의 세포주기 및 비대에서 출구이다. 비대 연골 세포 강력 X 형 콜라겐 매트릭스 메탈로 표현-13 (MMP13)와 종 방향 성장의 방향으로 자신의 상당한 볼륨 확대는 포유 동물 7,8에서 뼈의 성장에 가장 큰 기여를 제공합니다. 또한, 비후성 연골 매트릭스 소체의 방출을 통해 주변 ECM을 무기화 멤브레인 경계 구조는 포스파타제의 포함 (조직 비특이적 알칼리 포스파타제 (TNAP) 및 PHOSPHO1) 칼슘 채널링 단백질 (annexins 통해 비정질 인산 칼슘의 제조에 전문 ) 9-11. 이 석회화 연골은 파골 세포의 모집 및 매트릭스 흡수의 결과로 기본 골수에서 혈관에 의해 침략된다. 이것은 그들이 빠르게 광물이다 유골의 층을 아래로 누워 석회화 연골 잔재의 표면에 조골 세포의 이동 및 정렬옵니다. 기본 spongiosa의 짠 뼈는 나중에 보조 spongiosa (12)의 층상 뼈 리모델링된다. 에 골단 융합 결과연골 골화 (13)의 중단.
교란 현상 및 / 또는 뼈의 성장 길이 14을 방지하도록 연골 내 골화 많은 호르몬 분비 호르몬 및 성장 인자에 의해 엄격한 규제 받고있다. 이러한 프로세스를 뒷받침 분자 및 세포 메커니즘의 이해는 인간의 이익으로 임상 발전의 추구에 따라서 필수적이다. 유사점과 다른 나이, 위치와 종의 성장 판 사이의 차이에 대한 이전의 연구는 크게 성장판 역학 (15, 16)을 둘러싼 생리 학적 메커니즘에 대한 우리의 이해를 향상되었습니다. 자신의 환경에서 연골 세포의 제거는 Col2a1 (17)와 같은 주요 마커의 발현 감소와 함께, 탈분화로 이어질 수 그러나 고립 된 연골 세포의 연구는 어렵다.
마우스 에릭손 기관 체외 이식편 문화, 파이네덜란드의 교수 엘리자베스 버거와 동료에 의해 oneered, 문화 생체 (18)에서 본 것을 모방 뼈의 성장 속도로 연골 골화와 뼈의 성장을 연구하기위한 고도의 생리적 생체 모델입니다. 유니 클리, 중족골 기관 배양 따라서 문화 19 ~ 21 세포에 비해 생체 내 상황에 가까운 조건을 제공 연골의 다른 단계에서 연골 세포의 시험을 허용하고 세포 – 세포 및 세포 – 기질 상호 작용을 유지합니다. 또한,이 모델은 기본 연골 세포 배양에서 수 없습니다 선형 뼈의 성장을 직접 검사 수 있습니다. 또한 따라서 성장판 로컬 효과의 구체적인 분석을 허용 조직 및 지방 요소의 분리를 허용한다.
중족골의 문화는 다양한 매개 변수의 조사를 할 수 있습니다. 전체 길이와의 광물 지역의 일일 측정초보 표준 위상차 현미경과 화상 해석 소프트웨어로 수행 될 수있다. 동일계 하이브리드 화 및 면역 조직 염색의 조직학은 용이 셀룰러 분자 실체, 기존의 세포 배양 방법에 비해 큰 장점의 공간 해상도를 허용 중족골 부에서 수행 될 수있다. 면역 조직 화학적 방법은 연골 세포 (22) 증식에 의한 탐지 및 5- 브로 모 -2'- 데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 흡수의 정량화를 포함한다. 또한 중족골 조직의 추가적인 처리는 mRNA 발현 (RT-qPCR에), 단백질 및 세포 내 신호 분석 (웨스턴 블롯) 또는 지질 조성물 (질량 분석법) 하류의 분석을 허용하도록하여 수행 될 수있다. 현재까지 대부분의 연구는 산후 동물에서 배양 된 배아 중족골이 아닌 중족골을 사용합니다. 그들은 빠르게 성장하고 EXPLO 수 있습니다 : 두 모델은 정보가 될 수하는 동안, 배아 뼈의 연구는 몇 가지 장점이 있습니다제한없는이 광물 처리 23-25의 개시 및 진행을 공부합니다.
이 프로토콜은 구체적으로 배아 일 15 (E15) 쥐의 배아의 뒷다리에서 배아 중족골의 복잡한 해부에 대해 설명합니다. 또한, 해부학 적으로 별개의 중족골의 성장과 광물이 표시됩니다.
쥐의 배아 중족골의 문화는 연골의 성장과 광물의 높은 생리 학적 모델을 제공합니다. 초기 연구는 E15 마우스 중족골이 골격의 성장과 분화의 정상적인 패턴을 겪는 것을 확인했다. 연골 (연골) 및 뼈 (조골 세포와 파골 세포) 세포 및 해당 콜라겐 매트릭스는 생체 내에서 관찰 된 것과 구별된다. 그러나,이 모델의 어떤 인식 된 제한이있다. 파골 세포 분화의 속도는 (그러나 연골 분화를 생략)이다 뼈 성장을 손상한다. 뼈 성장을 생체 내에서 관찰되는 것보다 약 50 % 느린와 로컬 요인 (예를 들어, IGF-1, BMP 형식 등) (31)의 생산에 영향을 미치는 요인으로 전신 결핍에 기인 할 수있다. 또한, 잘 뼈 기계적 환경에 민감한 것으로 인식되고, 이는 또한 C 응답 배양 중족골에 대한 경우이다기계적로드 (32, 33)에 hanges. 따라서, 언로드 상황으로서이 프로토콜 광물에 기재된 미네랄 흡수가 손상 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 중족골 모델 직접 관내 배양 시스템에서 2D와 3D로 불가능 선형 뼈의 성장을 측정하는 능력을 제공한다.
우리는 처음 참 E15 쥐 중족골과의 박리 및 배양에 관련된 프로토콜의 포괄적 인 설명을 제공하고, 실험 2 차, 3 차 및 4 차 중족골 풀링의 유효성을 확인한다.
E17 / E18에서 중족골은 일반적으로 (문화 십사일 이상, 즉) 오랜 기간 동안 생체 성장을 자신의 특별한 잠재력으로 인해 뼈 성장의 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다. 이들은 배아 종 뼈 성장에 성장 인자의 역할을 조사하기 위해 확립 된 모델이다.또한, 생후 중족골의 절개 및 배양 일반적으로는 산후 뼈의 성장 및 태아의 뼈 성장 21 다르게 조절되는 것을 알 수있는 바와 같이 산후 뼈 성장을 둘러싼 메커니즘을 묘사하는데 사용된다. 배양 출생 중족골에서 관찰 된 뼈의 성장은 장기간의 연구에서 자신의 잠재력을 제한하고이 출생 후의 단계에서 뼈의 성장에 더 체계적인 영향을 강조하지만 배아 초보 25,34에서 관찰 된 것보다 훨씬 작다. 실제로, 마우스 3 일된 생후 중족골는 일반적으로 측정 성장 34를 얻는데 사용될 수있는 최신 단계이다.
여기에서 우리는 E15에서 배아 중족골 뼈의 분리에 대한 우리의 프로토콜을 설명합니다. E15의 중족골에 hydroxyapaptite 미네랄의 부재는 또한 길이 비교할 뼈 성장을 둘러싸뿐만 메커니즘을 조사하는 모델이지만 개시를 제공하는 것을 의미골격 광물. 터미널 비대 연골 세포 영역의 광물 행렬은 이후 광물 인 뼈 특정 매트릭스 (유골)을 누워 골아 세포 침입을위한 발판을 제공하고, 이러한 초기 광물로 성공적이고 기능적인 골 형성 (35)에 매우 중요합니다. 실제로 E15의 중족골을 이용하여 최근 보고서 수는 광물 처리 28,36,37의 조사를 위해 자신의 독특한 능력을 확인했다. 또한, 연구진은 뼈 성장 / 광물 설정 외부 모델로서 배아 중족골의 전위를 강조 혈관 (38)의 모델로 E15의 중족골의 사용을 설명했다.
우리가 설명하는 프로토콜은 층류 후드, 절개를 수행하기위한 해부 현미경 및 적출 초보의 문화에 대한 CO 2 배양기를 포함한 만 표준 실험실 장비를 필요로한다. 또한, 아주 기본적인 막 다른매체 αMEM, BSA, 항생제, 항진균제 및 L- 아스 코르 빈산 함유 진짜야 (하이드 록시 프롤린 및 히드 록시 리신의 합성 공동 인자, 콜라겐 (39)의 생산을위한 두 가지 필수 아미노산) 등의 동물 혈청로서 정의 첨가제의 사용을 피 . 전통적으로, 연구자들은 문화 배아 중족골에 사용되는 미디어에 βGP을 추가 한하지만 우리의 결과에 계시, 추가로 인산 소스의 사용이 문화 시스템의 성공적인 광물 필요하지 않습니다. 이 ECM 광물을 뒷받침하는 메커니즘을 이해하는 우리의 추구에서 중요한 발견이다.
중족골 이전 긴 뼈 (40)의 발달 조절에 성장 인자 β를 변화시키는 역할을 탐색 된 Smad2의 우성 음성 형태를 포함하는 아데노 바이러스로 감염되었다. 여기에서 우리는 t을 나타내는 GFP 바이러스 입자 야생형 E15의 중족골 뼈의 성공적인 형질 공개모자 렌티 기술 용이 중족골 배양에서 유전자 발현을 조작하기 위해 채택 될 수있다. 마찬가지로, 중족골 기관 배양 물 시스템은 더 골 성장 과정에서 특정 유전자의 역할을 이해하기 위해 유전자 변형 마우스의 뼈의 성장을 비교하기에 우수한 모델이다. 이전의 연구는 연골 내 골 성장 사이토 카인 시그널링 억제 -2- (SOCS2)의 역할을 결정하기 위해 중족골 기관 배양 시스템을 사용하고있다. SOCS2의 결핍 마우스에서 중족골 뼈를 사용하여, 그 성장 호르몬은 성장 인자와 같은 인슐린 그들의 길이 성장 독립적를 시뮬레이션 할 수있다 나타났다 (IGF-1), 성장 호르몬 치료 (34)에 반응하지 않는 야생형 중족골 달리 41. 이것은 중족골 배양 상이한 유전자 및 / 또는 연골 내 골 성장 외인성 요인의 영향을 조사하기 위해 조작 될 수있는 정도를 강조한다.
요약하면, 우리는 detai이조작 할 수있다 배아 중족골 뼈의 성공적인 추출 및 배양하는 방법을지도하고 다양한 분석을 이용하여 조사 하였다. 이 생체 모델은 따라서 단일 층 또는 3 차원 배양 세포보다 더 생리 학적 모델을 제공 할뿐만 아니라 연골의 다른 단계에서 연골 세포가 들어 있으므로, 세포 – 세포 및 세포 – 기질 상호 작용을 유지합니다. 에릭손 기관 배양 따라서 연골 골화을 담당하는 분자 메커니즘을 조사에 대해 고유 한 모델이며, 뼈 생리학 및 병태 생리 양에 대한 우리의 이해를 증진하는 것이 필수적이다
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C |
Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |