We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.
The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.
השלד הוא איבר מורכב, דינמי ומורכב מאוד כי יש מגוון של פונקציות הפורשות מן התנועה, הומאוסטזיס יון. מורכב העצם והסחוס, השלד מורכב של אוכלוסיות תאים מובחנות מבחינה תפקודית אשר פועלות כדי לשמור על זה מבני, ביוכימיים מכאני שלמות 1. אחד התפקידים העיקריים של השלד הוא התפקיד בהתפתחות וצמיחה שלה. תהליכים אלה דורשים התזמור של אוכלוסיות תאיות רבות אשר מוסדרות באמצעות האנדוקרינית דוקי בקרה גנטית.
למעט עצם השכמה למשל עצמות שטוחות, הגולגולת ועצם החזה, השלד היונק נוצר באמצעות התהליך המכונה התאבנות endochondral. תהליך זה, מוסדר, הן מולקולרי מרחבית, מתחיל עם ההתעבות של תאי mesenchymal נגזרו בעיקר מן mesoderm 2. בהשפעה של SOX9 גורם שעתוק, תאי הדואר פנים של condensations להתמיין chondrocytes, להביע ומפריש מטריקס ספציפיים סחוס (ECM) רכיבים כגון קולגן סוג II ו- aggrecan. תאים בשולים של העיבוי, לבטא סוג אני קולגן ויוצר את perichondrium, המגדיר את העצם 3 הפוטנציאלי. מאוחר יותר, osteoprogenitors של perichondrium להתמיין אוסטאובלסטים, בבימויו של הביטוי של גורמי שעתוק, Runx2 ו osterix 4. זה מוביל דומיננטי של אוסטאובלסטים ושכבה זה שמם של קרום העצם המהווה צווארון גרמי mineralized סביב אמצע הקטע של העצם. חדירה של כלי דם של קרום העצם והפלישה של פיגום הסחוסים מתרחשת מביאה עימה, haematopoetically שמקורם בתאי resorbing עצם, osteoclasts, אשר נספגים שוב ומצע שרידי הכונדרוציטים והרבה מטריקס סחוסי 5. החללים נוצרו מאוישים ע"י osteoprogenitors והוליד את ההתאבנות העיקריתמרכז אשר בהדרגה תופס את הליבה של diaphysis ומתמזג עם periosteum. תאים אחרים להצמיח במח העצם. בסביבות הלידה, כלי דם osteoprogenitors לחדור מטריקס עשיר סחוס משני צדי (epiphysis) של diaphysis פיתוח כדי ליצור את מרכז התאבנות משנית. ממוקם בין epiphysis ו diaphysis בשני קצותיו של העצמות הארוכות היא להקה של סחוס – צלחת צמיחת epiphyseal – האחראית על תיאום גידול ליניארי של כל העצמות הארוכות 6.
Chondrocytes בתוך צלחת הצמיחה בתחילה להתרבות ובהמשך להתקדם דרך אזורים ברורים מורפולוגית, מתואמים על ידי ביטוי רציף של גורמי שעתוק וצמיחה. שיאו של רצף זה של אירועים הוא היציאה ממעגל התא היפרטרופיה של כונדרוציטים במרכז מבשר סחוס זה. chondrocytes Hypertrophic בתוקף להביע קולגן סוג X ו- מטלו מטריקס-13 (MMP13) והגדלת הנפח הניכרת שלהם בכיוון של צמיחה אורכת מספקים את התרומה הגדולה ביותר לצמיחת עצם ביונקי 7,8. יתר על כן, chondrocytes היפרטרופית mineralize ECM הסובבת אותם באמצעות שחרור של שלפוחית מטריקס, מבנים מתוחם קרום מתמחה לייצור סידן פוספט אמורפי באמצעות הכללתם של phosphatases (רקמת הלא ספציפית phosphatase אלקליין (TNAP) ו PHOSPHO1) וחלבונים תקשור סידן (annexins ) 9-11. סחוס מסויד זה הוא פלש ידי כלי דם מהמח הבסיסי וכתוצאה מכך גיוס osteoclast ואת ספיגת מטריקס. זה ואחריו הגירה אוסטאובלסטים ויישור אל פני השטח של שרידי סחוס המסוידים שבו הם שכבו שכבה דמוית העצם שהוא mineralized במהירות. העצם הארוג של spongiosa העיקרי הוא ששופץ לעצם שבשבת של spongiosa משני 12. תוצאות היתוך epiphyseal בהפסקת התאבנות endochondral 13.
התאבנות Endochondral נמצאת תחת רגולציה הדוקה על ידי הורמונים האנדוקרינית paracrine רבים גורמי גדילה כדי למנוע התפתחות מופרעת ו / או צמיחת עצם אורך 14. הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים ותאיים שבבסיס התהליכים האלה לכן חובה במרדף שלנו של התקדמות קלינית כלפי רווחת אדם. מחקרים קודמים המצביעים על הדמיון והשוני בין צלחות הצמיחה בגילאים שונים, במקומות ומינים שיפרו במידה רבה את הבנתנו של מנגנונים פיזיולוגיים שמסביב הדינמיקה צלחת צמיחה 15,16. עם זאת, המחקר של כונדרוציטים מבודדים קשה, כמו הסרת chondrocytes מסביבתם יכולה להוביל dedifferentiation, מלווה אובדן הביטוי של סמני מפתח כגון Col2a1 17.
תרבות explant העכבר המסרק איבר, pioneered ידי פרופ 'אליזבת בורגר ועמיתיו בהולנד, הוא מודל פיסיולוגי לשעבר מאוד vivo ללימוד צמיחת התאבנות ועצמות endochondral כמו קצב הצמיחה של העצמות בתרבות לחקות כי ראה in vivo 18. באופן ייחודי, תרבות איבר כף הרגל מאפשרת בחינה של כונדרוציטים בשלבים שונים של chondrogenesis ושומרת תאי תאים ואינטראקציות תא-מטריצה, ולכן מתן תנאים קרובים למצב vivo ב מ תאים בתרבית 19-21. יתר על כן, מודל זה מאפשר לבדיקה ישירה של צמיחת עצם ליניארי אשר אינה אפשרית בתרבויות הכונדרוציטים עיקריות. זה גם מאפשר הפרדת גורמים מערכתיים ומקומיים ולכן מתיר הניתוח הפרטני של ההשפעות המקומיות על צלחת הצמיחה.
תרבות metatarsals מאפשרת לחקירת פרמטרים רבים. מדידות יומיות של אורך הכולל ושל אזורי mineralized שלניתן לבצע את היסודות עם מיקרוסקופ לעומת שלב סטנדרטי תוכנת ניתוח תמונה. היסטולוגית, כלאה באתר והכתים immunohistological עשויה להתבצע בקלות על סעיפי כף רגל, מה שמאפשר את הרזולוציה המרחבית של שני הגופים האלה תאיים ומולקולריים, יתרון גדול על פני שיטות תרבית תאים מסורתיות. הגישה immunohistochemical כולל איתור וכימות של 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) ספיגת ידי מתרבים chondrocytes 22. בנוסף, עיבוד נוסף של רקמות כף רגל ניתן לבצע כדי לאפשר ניתוח במורד זרם של ביטוי mRNA (RT-qPCR), חלבון וניתוח איתות תאי (מערבי סופג) או רכב שומנים (ספקטרומטריית מסה). רוב המחקרים שפורסמו עד כה להשתמש metatarsals עובריים בתרבית ולא metatarsals מחיות שלאחר הלידה. בעוד שני הדגמים ניתן אינפורמטיבי, חקר עצמות עובריות יש מספר יתרונות: הם גדלים מהר יותר והוא יכול להיות exploited ללמוד בייזום התקדמות של 23-25 תהליך מינרליזציה.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט את לנתיחה הסבוכה של metatarsals העוברי מן הגפיים האחוריים של יום עוברי 15 (E15) עובר Murine. יתר על כן, את הצמיחה ואת מינרליזציה של metatarsals מובחנת מבחינה אנטומית מוצג.
תרבות metatarsals בעכברים העוברי מספקת מודל פיסיולוגי ביותר של צמיחת endochondral מינרליזציה. מחקרים מוקדמים אימתו כי metatarsals עכבר E15 לעבור דפוס רגיל של צמיחה והבחנת שלד. הסחוס (chondrocytes) ועצמות (אוסטאובלסטים ו osteoclasts) תאים ומטריצות collagenous שלהם הם נבדלים מאלו שנצפו vivo. עם זאת, ישנן מספר מגבלות מוכרות של דגם זה. המהירות של בידול osteoclast נפגעת כמו גם צמיחת עצם (אבל לא סחוס בידול). צמיחת עצם היא כ 50% לאט יותר מאשר לזה שנצפה vivo ועלולה להיות כתוצאה מליקויי גורמים מערכתיים המשפיעים על הייצור של גורמים מקומיים (למשל, IGF-1, BMPs, וכו ') 31. כמו כן, הוא מוכר היטב כי העצם רגיש לסביבה המכאנית שלה וזה גם המקרה עבור metatarsals התרבותי, אשר מגיב גhanges ב 32,33 העמסה מכנית. לכן, במצבים טעונים, כמתואר בפרוטוקול זה, מינרליזציה ספיגת מינרלים עלולים להיות בסכנה. עם זאת, מודל כף הרגל מציע את היכולת למדוד ישירות צמיחת עצם ליניארי הדבר שאינו אפשרי באמצעות 2D and 3D במערכות תרבות במבחנה.
סיפקנו תיאור מקיף של פרוטוקול מעורב לנתיחה והתרבות של metatarsals murine E15 ואכן, בפעם הראשונה, לאשר את תוקפו של איגום 2 nd, 3 rd ו 4 th metatarsals לניסויים.
Metatarsals מ E17 / E18 משמש בדרך כלל כדי לחקור את המנגנונים של צמיחת עצם בשל הפוטנציאל יוצא הדופן שלהם לגדול vivo לשעבר לתקופות זמן ארוכות (כלומר מעבר 14 ימים בתרבות). הם מודל ומבוסס לחקור את התפקידים של גורמי גדילה על צמיחת עצם אורך עוברית.בנוסף, לנתיחה וההתרבות של metatarsals לאחר הלידה היא מועסק בדרך כלל כדי להתוות את המנגנונים סביב צמיחת עצם לאחר לידה כפי שהיא מובנת כי צמיחת עצם לאחר לידה וצמיחת עצם עוברית מוסדרות באופן שונה 21. צמיחת העצם שנצפתה metatarsals לאחר הלידה התרבותי היא אולם פחות משמעותי מזו שנצפתה יסודות עובריים 25,34, הגבלת הפוטנציאל שלהם במחקרים לטווח ארוכים הדגשת ההשפעה מערכתית יותר על צמיחת עצם בשלב לאחר לידה זה. ואכן, 3 metatarsals לאחר הלידה יממה מעכברים הם בדרך כלל השלב האחרון, שניתן להשתמש בהם כדי להשיג 34 הצמיחה למדידה.
כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו הבידוד של עצמות כף רגל עובריות E15. העדר מינרלי hydroxyapaptite בעצמות כף רגל E15 אומר שהם מספקים מודל תחרות לחקור לא רק את המנגנונים סביב צמיחת עצם אורכת, אלא גם הייזוםשל מינרליזציה השלד. המטריצה mineralized של אזור הכונדרוציטים היפרטרופית מסוף מספק פיגום לפלישה אוסטאובלסטים להניח את עצם ספציפי מטריקס (דמוי עצם) המהווה מכן mineralized, וכפי מינרליזציה כגון הראשוני הזה הוא חיוני היווצרות העצם מוצלח ופונקציונלי 35. ואכן מספר הדיווחים האחרונים ניצול metatarsals E15 אשר היכולת הייחודית שלהם לחקירה של 28,36,37 תהליך מינרליזציה. בנוסף, חוקרים תארו את שימוש metatarsals E15 כמודל של אנגיוגנזה 38, המדגישים את הפוטנציאל של metatarsals העוברי כמודל מחוץ הגדרת צמיחת העצם / מינרליזציה.
הפרוטוקול אנו מתארים דורש ציוד מעבדה רגיל בלבד כולל ברדס זרימה למינרית, מיקרוסקופ לנתח לביצוע הנתיחה, ו CO 2 באינקובטור לתרבות של יסודות ניכרים. יתר על כן, מבוי סתום מאוד בסיסיture בינוני המכיל αMEM, BSA, אנטיביוטיקה, antimycotics וחומצה L-אסקורבית (שיתוף גורם בסינתזה של hydroxyproline ו hydroxylysine, שתי חומצות האמינו החיוניות לייצור קולגן 39) ימנע את השימוש של תוספי מוגדר, כגון סרה חיה . באופן מסורתי, חוקרים הוסיפו βGP למדיה נהג metatarsals התרבות העוברי אבל כפי שמתגלה בתוצאות שלנו, שימוש מקור פוספט נוסף אינו נדרש עבור מינרליזציה מוצלח במערכת התרבות הזאת. זהו ממצא חשוב המרדף שלנו להבנת המנגנונים שבבסיס מינרליזציה ECM.
Metatarsals בעבר נדבקו adenoviruses ובתוכה טופסי דומיננטי שלילי של Smad2 לחקור את התפקיד של הפיכת β גורם הגדילה בוויסות התפתחות העצם ארוך 40. כאן אנו חושפים גם את transfection המוצלח של עצמות כף רגל E15 wild-type עם חלקיקי נגיף ה- GFP, המציין tכובע טכניקות lentiviral שאפשר לאמץ בקלות לתמרן ביטוי גנים בתרבויות כף הרגל. באופן דומה, מערכת התרבות איבר כף הרגל היא מודל מצוין בו כדי להשוות את הצמיחה של העצמות מעכברים שינו גנטי כדי להבין טוב יותר את תפקידו של גן מסוים בתהליך צמיחת עצם. המחקרים הקודמים שלנו נצלו את מערכת התרבות איבר כף רגל כדי לקבוע את התפקיד של מדכא של ציטוקינים איתות-2 (SOCS2) ב צמיחת עצם endochondral. שימוש עצמות המסרק מעכברים שחסר לו SOCS2, הראינו הורמון גדילה כי הוא מסוגל לדמות עצמאית הצמיחה האורך שלהם של אינסולין כמו גורם גדילה (IGF-1), שלא כמו עצמות כף הרגל wild-type אשר אינם מגיבים לטיפול בהורמון גדילה 34, 41. זה מדגיש את המידה שבה תרבויות כף רגל ניתן להשפיע כדי לבחון את ההשפעות של גנים שונים ו / או גורמים חיצוניים על צמיחת עצם endochondral.
לסיכום, יש לנו detaiהוביל שיטה להפקה והתרבות המוצלחת של עצמות כף רגל עובריות אשר ניתן מניפולציות ובדק באמצעות מגוון של ניתוחים. מודל vivo לשעבר זו שומר תאי תאים ואינטראקציות התא-מטריקס, וכן מכיל chondrocytes בשלבים שונים של chondrogenesis, ולכן מתן מודל פיסיולוגי יותר תאים בשכבה או תרבות 3D. תרבויות איבר כף הרגל ולכן מודל ייחודי לבדיקת המנגנונים המולקולריים האחראים התאבנות endochondral, והם חיוניים כדי לקדם את ההבנה שלנו של שני בפיזיולוגיה העצם והפתופיזיולוגיה
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C |
Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |