We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.
The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.
Le squelette est un organe très complexe, dynamique et complexe qui dispose d'une gamme de fonctions allant de l'locomotion, à l'homéostasie ionique. Constituée d'os et de cartilage, le squelette se compose de populations de cellules fonctionnellement distinctes qui fonctionnent pour maintenir les structures, l' intégrité mécanique et biochimique 1. L'une des principales fonctions du squelette est son rôle dans le développement et la croissance. Ces procédés nécessitent l'orchestration de plusieurs populations cellulaires qui sont réglementés par le biais du système endocrinien serré et le contrôle génétique.
A l'exception de l'os plats par exemple omoplate, crâne et sternum, le squelette des mammifères est formé par le procédé connu sous le nom ossification endochondrale. Ce processus, à la fois réglementé moléculairement et spatialement, commence par la condensation des cellules mésenchymateuses dérivées principalement du mésoderme 2. Sous l'influence du facteur SOX9 de transcription, les cellules de the intérieur des condensations se différencient en chondrocytes, exprimant et sécrétant des composants spécifiques du cartilage matrice extracellulaire (MEC), telles que le collagène de type II et de l'aggrécane. Les cellules à la marge de la condensation, expriment collagène de type I et la forme du périchondre, délimitant l'os prospective 3. Plus tard, les ostéoprogéniteurs du périchondre se différencier en ostéoblastes, réalisé par l'expression des facteurs de transcription, et Runx2 osterix 4. Cela conduit à une prédominance des ostéoblastes et cette couche est renommé le périoste, qui forme une collerette osseuse minéralisée autour de la section médiane de l'os. La pénétration vasculaire du périoste et de l' invasion de l'échafaudage cartilagineux se produit entraînant avec elle, haematopoetically dérivé des os, des cellules résorbant ostéoclastes qui résorbent les restes de chondrocytes et une grande partie de la matrice cartilagineuse 5. Les espaces formés sont remplis par ostéoprogéniteurs donnant lieu à l'ossification primairecentre qui occupe progressivement le noyau de la diaphyse et se confond avec le périoste. D'autres cellules donnent naissance à la moelle osseuse. Autour de la naissance, les vaisseaux sanguins et ostéoprogéniteurs pénètrent la matrice riche du cartilage de chaque côté (épiphyse) de la diaphyse de développement pour former le centre d'ossification secondaire. Situé entre l'épiphyse et la diaphyse à chaque extrémité des os longs est une bande de cartilage – la plaque de croissance épiphysaire – qui est chargé de coordonner la croissance linéaire de tous les os longs 6.
Chondrocytes au sein de la plaque de croissance initialement prolifèrent et progressent ensuite à travers des zones morphologiquement distinctes, coordonnés par l'expression séquentielle des facteurs de transcription et de croissance. L'aboutissement de cette séquence d'événements est la sortie du cycle cellulaire et de l'hypertrophie des chondrocytes au centre de ce précurseur du cartilage. chondrocytes hypertrophiques expriment fortement collagène de type X et de la matrice métalloprotéinase-13 (MMP13) et leur élargissement considérable du volume dans le sens de la croissance longitudinale fournit la plus grande contribution à la croissance osseuse chez les mammifères 7,8. En outre, les chondrocytes hypertrophiques minéraliser les ECM environnant grâce à la libération des vésicules matricielles, des structures de membrane délimitée spécialisés pour la production de phosphate de calcium amorphe par l'inclusion de phosphatases (tissu non-spécifique de la phosphatase alcaline (TNAP) et PHOSPHO1) et de calcium canaliser les protéines (annexines ) 9-11. Ce cartilage calcifié est envahi par les vaisseaux sanguins de la moelle sous-jacente résultant dans le recrutement des ostéoclastes et de la matrice de résorption. Elle est suivie par la migration des ostéoblastes et l'alignement sur la surface des restes de cartilage calcifiés où ils déposent une couche de ostéoïde qui est rapidement minéralisé. L'os tissé du spongieux primaire est ensuite remodelé à l' os lamellaire du spongieuse secondaire 12. les résultats de la fusion dans le épiphysairescessation de l' ossification endochondrale 13.
Ossification endochondrale est sous une réglementation stricte par de nombreux endocrines et paracrines hormones et facteurs de croissance de manière à empêcher le développement de troubles et / ou la croissance osseuse longitudinale 14. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent ces processus est donc impératif dans notre quête de progrès cliniques vers bénéfice de l'homme. Des recherches antérieures sur les similitudes et les différences entre les plaques de différents âges, les lieux et les espèces croissance ont grandement amélioré notre compréhension des mécanismes physiologiques dynamique de la plaque de croissance 15,16 environnantes. Cependant, l'étude des chondrocytes isolés est difficile, comme l' enlèvement des chondrocytes de leur environnement peut conduire à la dédifférenciation, accompagnée d' une perte d'expression de marqueurs clés tels que Col2a1 17.
Le métatarsien de la souris explant d'organe, pioneered par le Professeur Elisabeth Burger et ses collègues aux Pays – Bas, est un modèle ex vivo très physiologique pour étudier l' ossification endochondrale et la croissance osseuse que le taux des os dans la culture imitent celle observée in vivo 18 de croissance. Exceptionnellement, la culture d'organe métatarsien permet l'examen des chondrocytes dans les différentes phases de la chondrogenèse et maintient la cellule-cellule et les interactions cellule-matrice, fournissant ainsi des conditions plus proches de la situation in vivo de cellules en culture 19-21. En outre, ce modèle permet un examen direct de la croissance osseuse linéaire qui est impossible dans les cultures de chondrocytes primaires. Il permet également la séparation des facteurs systémiques et locaux donc permettant l'analyse spécifique des effets locaux sur la plaque de croissance.
La culture de métatarsiens permet d'enquêter sur de nombreux paramètres. Les mesures quotidiennes de la longueur totale et des régions minéraliséesles rudiments peuvent être réalisées avec un microscope à contraste de phase standard et des logiciels d'analyse d'images. Histologique, l' hybridation in situ et la coloration immunohistologique es peut être aisément effectuée sur des coupes du métatarse, qui permet la résolution spatiale des deux entités moléculaires et cellulaires, un grand avantage par rapport aux procédés de culture cellulaire classiques. L'approche immunohistochimique comprend la détection et la quantification de 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) , l' absorption par la prolifération des chondrocytes 22. De plus, le traitement ultérieur des tissus du métatarse peut être réalisée pour permettre une analyse en aval de l'expression d'ARNm (RT-qPCR), des protéines et analyse intracellulaire de signalisation (Western blot) ou de la composition lipidique (spectrométrie de masse). La plupart des études à ce jour utilisent métatarsiens embryonnaires cultivées plutôt que métatarses des animaux post-natal. Alors que les deux modèles peuvent être informatif, l'étude des os embryonnaires présente plusieurs avantages: ils se développent plus rapidement et peut être exploité pour étudier l'initiation et la progression du 23-25 de processus de minéralisation.
Ce protocole décrit en détail la dissection complexe de métatarsiens embryonnaires du membre postérieur du jour embryonnaire 15 (E15) des embryons murins. En outre, la croissance et la minéralisation des métatarsiens anatomiquement distincts est représentée.
La culture de métatarsiens embryonnaires murines fournit un modèle très physiologique de la croissance endochondral et de la minéralisation. Les premières études ont validé que métatarsiens de souris E15 subissent un modèle normal de la croissance du squelette et la différenciation. Le cartilage (chondrocytes) et de l' os (ostéoblastes et ostéoclastes) cellules et leurs matrices collagènes respectives sont indiscernables de ceux observés in vivo. Cependant, il existe certaines limitations reconnues de ce modèle. La vitesse de la différenciation des ostéoclastes est altérée en est la croissance osseuse (mais pas cartilage différenciation). La croissance osseuse est d' environ 50% plus lente que celle observée in vivo et peut être due à des carences en facteurs systémiques qui influent sur la production de facteurs locaux (par exemple, l' IGF-1, PGB, etc.) 31. En outre, il est bien reconnu que l'os est sensible à son environnement mécanique et cela est également le cas pour les métatarses de culture, qui répondent à changements en mécanique de chargement 32,33. Par conséquent, dans des situations non chargées, comme décrit dans ce protocole, la minéralisation et la résorption minérale peut être compromise. Néanmoins, le modèle du métatarse offre la possibilité de mesurer directement la croissance osseuse linéaire , ce qui est impossible par l' intermédiaire 2D et 3D dans les systèmes de culture in vitro.
Nous avons fourni une description complète du protocole impliqué dans la dissection et la culture de E15 métatarsiens murins et , en fait, pour la première fois, confirmer la validité de la mise en commun des 2 e, 3 e et 4 e métatarsiens pour des expériences.
Métatarsiens de E17 / E18 sont couramment utilisés pour étudier les mécanismes de la croissance osseuse en raison de leur extraordinaire potentiel de croître ex vivo pendant de longues périodes de temps (c. -à- delà de 14 jours dans la culture). Ils sont un modèle bien établi pour enquêter sur le rôle des facteurs de croissance sur la croissance embryonnaire osseuse longitudinale.En outre, la dissection et la culture des métatarsiens postnatals est couramment utilisés pour délimiter les mécanismes entourant la croissance osseuse postnatale comme il est entendu que la croissance osseuse post – natale et la croissance osseuse du fœtus sont réglementés différemment 21. La croissance osseuse observée dans métatarsiens postnatals culture est cependant nettement inférieure à celle observée dans les ébauches embryonnaires 25,34, ce qui limite leur potentiel dans des études à long terme et de mettre en évidence l'influence plus systémique sur la croissance osseuse à ce stade postnatal. En effet, 3 jours anciens métatarsiens postnatals de souris sont généralement la dernière étape qui peut être utilisé pour obtenir 34 croissance mesurable.
Nous décrivons ici notre protocole pour l'isolement des os métatarsiens embryonnaires à E15. L'absence d'hydroxyapatite minérale dans E15 métatarsiens signifie qu'ils fournissent un modèle sans égal pour étudier non seulement les mécanismes entourant la croissance osseuse longitudinal, mais aussi l'ouverturede la minéralisation du squelette. La matrice minéralisée de la zone de chondrocytes hypertrophiques terminal fournit un échafaudage pour envahir ostéoblastes d'établir une matrice osseuse spécifique (ostéoïde) qui est ensuite minéralisée, et en tant que telle , cette minéralisation initiale est vital pour la formation osseuse réussie et fonctionnelle 35. En effet , un certain nombre de rapports récents utilisant métatarsiens E15 ont confirmé leur capacité unique pour l'enquête sur le 28,36,37 de processus de minéralisation. En outre, les chercheurs ont décrit l'utilisation de métatarsiens E15 comme un modèle de l' angiogenèse 38, mettant en évidence le potentiel des métatarsiens embryonnaires comme modèle en dehors du cadre croissance osseuse / minéralisation.
Le protocole que nous décrivons ne nécessite qu'un équipement de laboratoire standard , y compris une hotte à flux laminaire, un microscope à dissection pour effectuer la dissection, et un incubateur à CO2 pour la culture de rudiment excisées. En outre, un cul très basiqueture contenant du milieu aMEM, la BSA, des antibiotiques, des antimycotiques et de l' acide L-ascorbique (un co-facteur dans la synthèse de l' hydroxyproline et de l' hydroxylysine, deux acides aminés essentiels pour la production de collagène 39) permet d' éviter l'utilisation d'additifs non définis, tels que des sérums animaux . Traditionnellement, les chercheurs ont ajouté βGP aux médias utilisés pour la culture métatarsiens embryonnaires, mais comme l'a révélé dans nos résultats, l'utilisation d'une source de phosphate supplémentaire ne sont pas requis pour la minéralisation du succès dans ce système de culture. Cette constatation est importante dans notre quête de la compréhension des mécanismes qui sous-tendent ECM minéralisation.
Métatarsiens ont déjà été infectées par des adénovirus contenant des formes dominantes négatives de Smad2 pour explorer le rôle de facteur de croissance transformant β dans la régulation du développement des os longs 40. Ici, nous révélons également la transfection réussie de type sauvage os E15 métatarsiens avec des particules de virus de la GFP, ce qui indique ttechniques chapeau lentiviraux pourraient facilement être adoptées pour manipuler l'expression des gènes dans les cultures du métatarse. De même, le système de culture d'organe métatarsienne est un excellent modèle pour comparer la croissance des os chez des souris génétiquement modifiées pour mieux comprendre le rôle d'un gène particulier dans le processus de croissance osseuse. Nos études antérieures ont utilisé le système de culture d'organes métatarsien pour déterminer le rôle de suppresseur de cytokine de signalisation-2 (SOCS2) dans la croissance des os endochondral. Utilisation des os métatarsiens de souris déficientes en SOCS2, nous avons montré que l' hormone de croissance est capable de simuler leur croissance longitudinale indépendante de l' insuline comme facteur de croissance (IGF-1), à la différence des os métatarsiens de type sauvage qui ne répondent pas à la croissance un traitement hormonal 34, 41. Cela met en évidence la mesure dans laquelle les cultures du métatarse peuvent être manipulées pour examiner les effets des différents gènes et / ou de facteurs exogènes sur la croissance osseuse endochondrale.
En résumé, nous avons detaiconduit un procédé pour l'extraction réussie et la culture des métatarsiens embryonnaires qui peuvent être manipulées et examinées en utilisant une variété d'analyses. Ce modèle ex vivo maintient cellule-cellule et les interactions cellule-matrice, ainsi que contient des chondrocytes dans les différentes phases de la chondrogenèse, fournissant ainsi un modèle plus physiologique que les cellules de la monocouche ou de la culture 3D. cultures d'organes métatarsien sont donc un modèle unique pour étudier les mécanismes moléculaires responsables de l'ossification endochondrale, et sont essentielles pour mieux comprendre à la fois la physiologie osseuse et la physiopathologie
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C |
Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |