We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.
The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.
骨骼是有一系列的运动跨越功能,离子平衡一个高度复杂的,动态的和复杂的器官。由骨和软骨,骨骼是由哪些运行,以维持它的结构,生化和机械完整性1功能不同的细胞群。一个的骨架的主要功能是其在发育和生长的作用。这些过程需要哪些是通过紧密的内分泌和遗传控制调节多种细胞群的编排。
与扁骨例如肩胛骨,颅骨和胸骨的例外,哺乳动物骨架是通过被称为软骨内骨化的方法形成。这个过程中,调节这两个分子和空间,便从主要来自中胚层2间充质细胞的冷凝。下的转录因子SOX9的影响,将细胞在第的冷凝电子内部分化成软骨细胞,表达和分泌软骨特异性细胞外基质(ECM)组分,例如II型胶原和软骨聚集蛋白聚糖。在冷凝的保证金,细胞表达I型胶原,形成软骨膜,划定未来的骨3。以后,软骨膜的骨原分化成成骨细胞,由转录因子,Runx2的和osterix的4的表达定向。这导致成骨细胞的优势,这层被重命名其形成围绕骨的中间部分矿化骨衣领骨膜。软骨支架的骨膜和侵袭的血管发生渗透与它带来,haematopoetically衍生骨再吸收细胞,破骨细胞,从而再吸收软骨细胞残余,大部分软骨基质5。所形成的空间由骨原引起的初级骨化填充中心,逐渐占据了骨干的核心,并与骨膜融合。其他细胞产生骨髓。生左右,血管和骨原在显影骨干的任一侧(骨骺)穿透软骨富基质以形成二次骨化中心。位于骨骺与骨干在长骨的两端之间,软骨带-骨骺生长板-这是负责协调所有长骨6的线性增长。
生长板软骨细胞内增殖最初并随后通过形态不同的区域,通过转录和生长因子的表达顺序协调推进。这一系列事件的顶点是由软骨细胞的细胞周期和肥大在此软骨前体的中心的出口。肥大软骨细胞高效表达X型胶原和基质金属蛋白酶-13(MMP13),并在纵向生长的方向其相当量放大提供在哺乳动物7,8骨生长最大的贡献。此外,肥大软骨细胞通过基质囊泡的释放矿化其周围的ECM,膜为界的结构,通过将其列入磷酸(组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)和PHOSPHO1)和钙窜蛋白质(膜联蛋白专门用于生产无定形的磷酸钙的)9-11。这钙化软骨是由血管日起,破骨细胞招聘和吸收矩阵的基本骨髓侵犯。其次是成骨细胞的迁移和对准到他们放下类骨质的一个层,其迅速矿化钙化软骨残余的表面上。主松质的编织骨稍后改造到辅助松质12的板层骨。骺融合结果在软骨内骨化13停止。
软骨内骨化是根据由许多内分泌和旁分泌激素和生长因子紧调节,以便防止干扰的发展和/或纵向的骨生长14。更好地了解支持这些过程的分子和细胞机制是因此我们的追求,对人类的好处临床进展势在必行。以往的研究进的相似点和不同年龄,地点和物种生长板之间的差异极大地提高了我们的周围生长板的动态15,16的生理机制的理解。然而,分离的软骨细胞的研究中是困难的,因为去除他们的环境的软骨细胞可导致去分化,伴随键标记如的Col2a1 17的表达缺失。
鼠标跖骨器官移植培养,PI伊丽莎白伯格和他的同事在荷兰教授oneered,是研究软骨内骨化和骨骼生长在文化模仿看到体内 18骨骼的生长速度高度生理体外模型。唯一地,跖骨器官培养允许软骨的不同阶段软骨细胞的检查和维护细胞-细胞和细胞-基质相互作用,因此提供比细胞培养19-21接近于体内情况的条件。此外,该模型允许线性骨生长的直接检查,这是不可能在初级软骨细胞培养物。它也允许对全身和局部因素因此允许对生长板的局部效应的具体分析的分离。
跖骨的文化使得众多参数的调查。总长度和矿化的区域中的每日测量雏形可以用标准相差显微镜和图像分析软件来执行。组织学,原位杂交和免疫组织学染色可以在跖骨部分,其允许细胞和分子实体,比传统的细胞培养方法的一个主要优势的空间分辨率可容易地进行。免疫组织化学方法包括由增殖的软骨细胞22的检测和5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)标记的摄取的量化。此外,可以执行跖骨组织的进一步处理,以允许mRNA的表达(RT-qPCR的),蛋白质和细胞内信号分析(蛋白质印迹)或脂质组合物(质谱法)的下游分析。迄今为止大部分研究使用的胚胎培养跖骨,而不是从跖骨产后的动物。虽然这两种模式可以是信息,胚胎骨骼的研究有几大优势:他们的成长速度更快,可以EXPLO资讯科技教育,研究矿化过程23-25的启动和发展。
这个协议进行详细描述胚胎跖骨从胚胎第15天(E15)小鼠胚胎的后肢的错综复杂的清扫。此外,独特的解剖学跖骨的生长和矿化所示。
小鼠胚胎跖骨的文化提供了软骨的生长和矿化的高度生理模型。早期的研究已经证实,E15小鼠跖骨经受骨骼生长和分化的正常模式。软骨(软骨细胞)和骨(成骨细胞和破骨细胞)细胞和它们各自的胶原基质是从那些在体内观察到的没有区别。不过,也有这种模式的一些公认的局限。破骨细胞分化的速度受损原样骨生长(但不软骨分化)。骨生长是比在体内观察到的大约慢50%,并且在其中影响生产的局部因素( 例如 ,IGF-1,骨形成蛋白等 )31全身因素可能是由于缺陷。此外,众所周知,骨是其机械环境敏感,这也是培养跖骨,其中至c响应的情况下hanges在机械负荷32,33。因此,在无负载的情况下,如在该协议中,矿化描述和矿物质吸收可能会受到损害。然而,跖骨模型提供直接测量线性骨生长经由2D和3D是不可能的体外培养系统的能力。
我们已经提供了参与E15鼠跖骨确实的解剖和文化,首次协议的全面描述,确认汇集第2, 第 3 和 第 4跖骨为实验的有效性。
从E17 / E18跖骨通常用于研究骨生长由于它们的巨大潜力的机制,以生长体外的时间( 即超过14天培养)长时间。他们是一个行之有效的模型来研究胚胎骨的纵向生长的生长因子的作用。此外,产后跖骨的解剖和培养一般用来作为可以理解的是出生后骨骼生长和胎儿骨生长被不同地21调节以描绘周围产后骨生长的机制。然而,在出生后的培养跖骨观察到的骨骼生长比在胚胎萌芽25,34观察显著较少,限制了其在长期研究的潜力,并强调在这个阶段出生后对骨骼生长更加系统性的影响。的确,从小鼠3天旧产后跖骨通常可用于获得可测量的增长34的最新阶段。
在这里,我们描述了胚胎跖骨在E15的隔离我们的协议。由于没有在E15跖骨羟基磷灰石矿物的装置,它们提供了无与伦比模型来研究不仅周围纵向骨生长的机制,而且还引发骨骼矿化。终端肥大软骨细胞区的矿化基质提供了侵入成骨细胞放下一个骨特异性基质(类骨质),这是随后矿化的支架,因此这个初始的矿化是成功和功能骨形成35是至关重要的。事实上,一些利用E15跖骨最近的报告证实了其独特的矿化过程28,36,37的调查能力。此外,研究人员已经描述了使用E15跖骨血管生成38的模型,突出胚胎跖骨作为骨生长/矿化设置外模型的潜力。
我们描述了协议只需要标准的实验室设备,包括一个层流罩,用于执行解剖解剖显微镜,并在 CO 2培养箱中切下的初步知识的培养。此外,一个非常基本的尽头TURE介质含有αMEM,BSA,抗生素,抗真菌剂和L-抗坏血酸(羟脯氨酸和羟赖氨酸合成的辅因子,两个基本氨基酸用于生产胶原39)避免了使用未定义的添加剂,如动物血清的。传统上,研究者已加入βGP用来培养胚胎跖骨媒体,但在我们的研究结果发现,不要求在此培养系统成功矿化使用额外的磷酸盐源的。这是我们的追求,理解支撑ECM矿化机制的一个重要发现。
跖骨先前已感染了含有的Smad2的显性负形式探索长骨发育40的调节转化生长因子β的作用腺病毒。在这里我们也揭示野生型E15跖骨与GFP病毒颗粒成功转染,表明Ť帽子慢病毒技术可以很容易地通过操纵在跖骨的文化基因的表达。同样,跖骨器官培养系统是在其中进行比较的骨头从遗传上改变的小鼠的生长,以更好地理解特定基因在骨生长过程中的作用的优秀模型。我们以前的研究中使用的跖骨器官培养系统,以确定细胞因子抑制信号-2(SOCS2)的软骨内成骨生长的作用。使用从SOCS2缺陷的小鼠跖骨,我们已经表明,生长激素能模拟其纵向生长独立胰岛素样生长因子的(IGF-1),与野生型跖骨不生长激素治疗34反应, 41。这突出到跖骨培养物可以被操纵来检查不同的基因和/或在软骨内骨生长外在因素的影响的程度。
总之,我们有德泰导致胚胎跖骨其可以被操纵的成功提取和培养的方法,以及使用各种分析检查。此体外模型保持细胞-细胞和细胞-基质相互作用,以及包含在软骨的不同阶段的软骨细胞,因此提供了比单层或三维培养的细胞的多种生理模型。因此跖骨器官培养是调查负责软骨内骨化的分子机制的独特模式,并必须进一步推动我们双方骨生理和病理生理的认识
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C |
Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |