Ingeniør Kunstige Faktorer å Spesifikt Manipulere alternativ spleising i humane celler

De fleste humane gener undergå alternativ spleising (AS) for å produsere flere isoformer med forskjellige aktiviteter, som i stor grad har økt kompleksiteten koding av genomet ^{1, 2.} AS gir er en hovedmekanisme for å regulere gen-funksjon, og det er strengt regulert ved forskjellige baner i forskjellige cellulære og utviklingsstadier ^{3, 4.} Fordi spleising misregulation er en vanlig årsak til human sykdom ^{5, 6, 7, 8,} rettet spleising regulering blir et attraktivt terapeutisk rute.

I henhold til en forenklet modell av spleising regulering, AS er i hovedsak kontrollert av spleising Regulatory cis -Elements (SRE) i pre-mRNA som fungerer som spleise forsterkere eller dempere av alternative eksoner. thEse SREs rekrutterer spesifikt ulike transaktive proteinfaktorer ( dvs. spleisefaktorer) som fremmer eller undertrykker spleisereaksjonen ^{3 , 9} . De fleste transaktive spleisefaktorer har separate sekvensspesifikke RNA-bindende domener for å gjenkjenne deres mål og effektor-domener for å kontrollere spleising. De mest kjente eksemplene er medlemmene av den serine / argininrike (SR) proteinfamilien som inneholder N-terminale RNA-anerkjennelsesmotiver (RRMs), som binder exoniske spleiseforsterkere og C-terminale RS-domener, som fremmer exon-inklusjon ¹⁰ . Omvendt binder hnRNP A1 til exonic splice-silencers gjennom RRM-domenene og hemmer ekson-inkludering gjennom et C-terminalt glycinrikt domene ¹¹ . Ved hjelp av slike modulære konfigurasjoner bør forskere kunne konstruere kunstige spleisningsfaktorer ved å kombinere et bestemt RNA-Binding Domain (RBD) med forskjellig effekttor domener som aktiverer eller hemmer spleising.

Nøkkelen av en slik konstruksjon er å bruke en RBD som gjenkjenner gitt mål med programmerbar RNA-bindende spesifisitet, som er analog med den DNA-bindende modusen for den TALE-domenet. Men de fleste naturlige spleise faktorer inneholder RRM eller K Homologi (KH) domener, som gjenkjenner korte RNA-elementer med svak affinitet og således mangler en prediktiv RNA-proteingjenkjennings "kode" ^12. Den RBD av PUF vendende proteiner (dvs. PUF domene) har et unikt gjenkjennings RNA-modus, noe som tillater den nye utformingen av PUF domener til spesifikt å gjenkjenne forskjellige RNA er rettet mot ^{13, 14.} Kanonisk PUF domene inneholder åtte gjentagelser av tre a-helikser, som hver gjenkjenner en enkelt base i et 8-nt RNA target. Sidekjedene til aminosyrene i visse posisjoner av de nest α-heliks skjema spesifikke hydrogenbindinger med Watson-Crick kant av tHan RNA base, som bestemmer den RNA bindende spesifisitet av hver repetisjon ( figur 1A ). Koden for RNA-base-anerkjennelse av PUF-gjenta er overraskende enkel ( figur 1A ), slik at generering av PUF-domener som gjenkjenner en mulig 8-basekombinasjon (gjennomgått av Wei og Wang ¹⁵ ).

Dette modulære designprinsippet tillater generering av en Engineered Splicing Factor (ESF) som består av et tilpasset PUF-domene og et splicing-modulasjonsdomene ( dvs. et SR-domene eller et Gly-rikt domene). Disse ESFene kan fungere som enten spleiseaktivatorer eller som inhibitorer for å kontrollere ulike typer spleisehendelser, og de har vist seg nyttige som verktøy for å manipulere spleising av endogene gener relatert til menneskers sykdom ^{16 , 17} . Som et eksempel har vi konstruert PUF-Gly-type ESFer for å spesifikt endre spleising av Bcl-x-genet, Konvertering av anti-apoptotisk lang isoform (Bcl-xL) til pro-apoptotisk kort isoform (Bcl-xS). Forandring av forholdet mellom Bcl-x isoformen var tilstrekkelig til å sensibilisere flere kreftceller til flere anti-kreft kjemoterapi-legemidler ¹⁶ , noe som tyder på at disse kunstige faktorene kan være nyttige som potensielle terapeutiske reagenser.

I tillegg til å kontrollere spleising med kjente spleiseffektor-domener ( f.eks. Et RS- eller Gly-rikt domene), kan de konstruerte PUF-faktorene også brukes til å undersøke aktivitetene til nye spleisningsfaktorer. Ved å bruke denne tilnærmingen har vi for eksempel vist at det C-terminale domenet til flere SR-proteiner kan aktivere eller hemme spleising ved binding til forskjellige pre-mRNA-regioner ¹⁸ , at det alaninrike motivet av RBM4 kan hemme spleising ¹⁹ og at Det prolinrike motivet til DAZAP1 kan forbedre spleising ^{20 , 21 <}/ Sup>. Disse nye funksjonelle domener kan brukes til å konstruere andre typer kunstige faktorer for å finjustere spleising.