Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas
Summary
Este relatório descreve um método de bioengenharia para conceber e construir novos factores de splicing artificial (ASFS) que modulam especificamente a splicing de genes alvo em células de mamífero. Este método pode ser expandido para manipular vários fatores artificiais para manipular outros aspectos do metabolismo do ARN.
Abstract
O processamento da maioria dos ARNs eucarióticos é mediado por RNA Binding Proteins (RBPs) com configurações modulares, incluindo um módulo de reconhecimento de ARN, que se liga especificamente ao alvo pré-ARNm e a um domínio efector. Anteriormente, tomamos vantagem do modo de ligação de ARN único do domínio PUF em Pumilio 1 humano para gerar um andaime de ligação de ARN programável, que foi utilizado para criar várias RBPs artificiais para manipular o metabolismo de ARN. Aqui, descreve-se um protocolo detalhado para construir Factores de Splicing Engineered (ESFs) que são especificamente concebidos para modular o splicing alternativo de genes alvo. O protocolo inclui como conceber e construir um andaime PUF personalizado para um alvo de ARN específico, como construir um plasmídeo de expressão de ESF fundindo um domínio PUF de design e um domínio efector, e como utilizar ESFs para manipular o empalme de genes alvo. Nos resultados representativos deste método, descrevemos também os ensaios comunsdas actividades do FSE utilizando repórteres de splicing, a aplicação de FSE em células humanas em cultura, e o subsequente efeito de alterações de splicing. Ao seguir os protocolos detalhados neste relatório, é possível projetar e gerar ESFs para a regulação de diferentes tipos de splicing alternativo (AS), proporcionando uma nova estratégia para estudar regulação do splicing ea função de diferentes isoformas de splicing. Além disso, através da fusão de diferentes domínios funcionais, com um domínio PUF concebidos, os investigadores podem engendrar fatores artificiais que têm como alvo RNAs específicos para manipular vários passos de processamento do ARN.
Introduction
A maioria dos genes humanos sofrer splicing alternativo (AS) para produzir múltiplas isoformas com actividades distintas, o que tem aumentado grandemente a complexidade de codificao do genoma 1, 2. AS fornece um importante mecanismo para regular a funo do gene, e que é fortemente regulada através de diversas vias celulares em diferentes estágios de desenvolvimento e 3, 4. Porque splicing desregulação é uma causa comum de doenças humanas 5, 6, 7, 8, segmentação regulação de splicing é a tornar-se um percurso terapêutico atractivo.
De acordo com um modelo simplificado de regulação de splicing, como é controlada principalmente por splicing Regulatory cis -Elements (SRE) em pré-ARNm que funcionam como intensificadores de splicing ou silenciadores de exs alternativos. ºEstas SREs recrutam especificamente vários fatores de proteína de transação ( isto é, fatores de splicing) que promovem ou suprimem a reação de splicing 3 , 9 . A maioria dos fatores de splicing em trans tem domínios de ligação de ARN específicos de seqüência separados para reconhecer seus alvos e domínios efetores para controlar splicing. Os exemplos mais conhecidos são os membros da família de proteínas ricas em serina / arginina (SR) que contêm Motivos de Reconhecimento de RNA N-terminais (RRMs), que se ligam a intensificadores de empasamento exónico e domínios RS C-terminais, que promovem a inclusão de exões 10 . Inversamente, o hnRNP A1 liga-se a silenciadores de empacotamento exónico através dos domínios RRM e inibe a inclusão do exão através de um domínio rico em glicina C-terminal 11 . Usando tais configurações modulares, os pesquisadores devem ser capazes de criar fatores de splicing artificial combinando um domínio de ligação a RNA específico (RBD) com diferentes efetor domínios que activam ou inibem a splicing.
A chave de um tal desenho é a utilização de um RBD que reconhece dado alvos com especificidade de ligação de ARN programável, que é análogo ao modo de ligação do ADN do domínio história. No entanto, a maioria dos factores de splicing nativas conter RRM ou K Homologia (KH), que reconhecem os domínios elementos de ARN curtos com afinidade fraca e, portanto, carecem de um "código de" reconhecimento de ARN-proteína de previsão 12. O RBD de proteínas de repetição de PUF (isto é, o domínio PUF) tem um modo de reconhecimento de RNA original, permitindo a remodelação de domínios de PUF para reconhecer especificamente ARN de diferentes alvos 13, 14. O domínio PUF canónica contém oito repetições de três hélices a, cada um reconhecendo um único base num alvo de ARN 8-nt. As cadeias laterais de aminoácidos em certas posições das ligações de hidrogénio específicas segunda forma α-hélice com a borda de Watson-Crick de tele ARN base, que determina a especificidade de ligao de ARN de cada repetição (Figura 1A). O código de reconhecimento de ARN de base da repetição PUF é surpreendentemente simples (Figura 1A), permitindo a geração de domínios de PUF que reconhecem qualquer combinação de 8-base de possível (revisto por Wei Wang e 15).
Este princípio de construção modular permite a geração de um Factor de Splicing Engineered (FSE) que consiste de um domínio PUF personalizado e um domio de modulao de splicing (isto é, um domínio SR ou um domínio Gli-rico). Estes ESF pode funcionar como activadores de splicing ou como inibidores para controlar vários tipos de eventos de splicing, e que provaram ser úteis como ferramentas para manipular o splicing de genes endógenos relacionados com a doença humana 16, 17. Como um exemplo, nós construímos ESF-Gli-tipo PUF para alterar especificamente o splicing do gene de Bcl-x, Convertendo a isoforma longa anti-apoptótica (Bcl-XL) ao curto isoformas pró-apoptótica (Bcl-XS). Mudando a relação entre a Bcl-x isoforma foi suficiente para sensibilizar várias células cancerosas a múltiplas drogas de quimioterapia anti-cancro 16, sugerindo que estes fatores artificiais podem ser úteis como reagentes terapêuticos potenciais.
Além de controlar o splicing com domínios splicing efectoras conhecidos (por exemplo, um cabo RS ou domínio Gli-rica), os factores de PUF modificados também podem ser utilizados para examinar as actividades dos novos factores de splicing. Por exemplo, utilizando esta abordagem, que demonstraram que o domínio C-terminal de vias proteas SR pode activar ou inibir o splicing quando se ligarem a diferentes regiões pre-mRNA 18, que o motivo rico em alanina de RBM4 pode inibir o splicing 19, e que o motivo rico em prolina de DAZAP1 pode melhorar splicing 20, 21 </ Sup>. Estes novos domínios funcionais podem ser utilizados para construir os tipos adicionais de fatores artificiais para afinar o splicing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este relatório fornece uma descrição detalhada para o projeto e construção de fatores artificiais de splicing que podem manipular especificamente o splicing alternativo de um gene alvo. Este método tira vantagem do modo de ligação de ARN único de repetições de PUF para produzir um andaime de ligação de ARN com especificidade personalizada. Ele pode ser usado para ativar ou reprimir splicing.
A etapa crítica neste protocolo é a geração do domínio reprogramado PUF que define …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NIH subvenção R01-CA158283 e NSFC conceder 31400726 a ZWYW é financiado pelo Programa de Jovens Mil Talentos e da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (subvenções 31471235 e 81422038). XY é financiado pela fundação de ciência pós-doutoral da China (2015M571612).
Materials
| High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7638-5G | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
| PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-lysine | Sigma | P-4832 | Filter sterilize and store at 4 °C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |
Referencias
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